3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

119

торый проникает внутрь липосом, где образует гель или осадок. Этот метод позволяет концентрировать внутри липосом разнообразные лекарственные вещества, включая эпирубицин, винка-алкалоиды, эллиптицины, камптотецины. Эффективность загрузки близка к 100%, концентрация лекарства в липосомах очень велика, при этом липосомы сохраняют высокую стабильность. Этот подход оказался весьма эффективным и успешно используется в более поздних работах, например, для загрузки доксору-

бицина [947,948].

Для обеспечения специфической адресации липосом используются моноклональные антитела. Моноклональные антитела являются моноспецифическими идентичными молекулами, продуцируемыми одним типом иммунных клеток, которые являются клоном одной родительской клетки. В названиях моноклональных антител, используемых для создания лекарственных препаратов, имеется окончание – маб (-mab), например: ритуксимаб, базиликсимаб, гемтуцумаб и т.д. (Табл. 2).

Таблица 2. Список некоторых моноклональных антител, используемых для создания иммунолипосом.

Как видно из таблицы, при создании иммунолипосом используются химерные и гуманизованные антитела. Их создание связано с тем, что антитела животных отличаются от антител человека. Поэтому при попадании в кровь они распознаются, как чужеродные, и вызывают иммунный ответ, что приводит к их быстрому удалению из русла крови и вызывает процессы воспаления. Получение человеческих антител невозможно по этическим соображениям. Кроме того, получение человеческих антител против тканей человеческого тела затруднительно по техническим причинам. Для преодоления этих проблем были созданы гены антител, коди-

120

рующих часть антител мыши и человека. Такие антитела можно продуцировать на культурах клеток человека. В зависимости от того, насколько велика часть мышиных антител в конечном продукте, их называют химерными или гуманизованными. Химерные антитела содержат 65% человеческих, тогда как гуманизованные – около 95%. Однако афинность гуманизованных антител существенно ниже [958]. Кроме того, прикрепление антител к липосомам приводит к дальнейшему снижению активности взаимодействия антител с антигеном. Так, моноклональные антитела трастузумаб имеют высокую активность по отношению к антигену HER2/neu близкую к 95%. Но в составе иммунолипосом активность падает до 2,0 – 4,5% [956]. В расчете на одно антитело связывание липосом с клеткамимишенями ослабевает приблизительно в 15 раз, по сравнению со свободными антителами, что, вероятно, связано со стерическими препятствиями, возникающими при взаимодействии липосом с поверхностью клетки [959]. Однако, это снижение может компенсироваться при пересчете на целую липосому, которая несет множество антител, взаимодействующих с поверхностью одновременно (Рис.12).

Рис.12. Иммунолипосома взаимодействует с антигенами на поверхности клетки. Из десяти антител, изображенных на схеме, только пять не имеют стерических препятствий для взаимодействия с поверхностью клетки. Следовательно, в пересчете на одно антитело, силы взаимодействия снижаются в два раза. Однако для всей липосомы суммарная сила взаимодействия в пять раз выше, чем для одного антитела.

В настоящее время производится более 160 различных моноклональных антител, разрешенных к использованию в медицинской практике. Более десяти препаратов моноклональных антител успешно прошли клинические испытания и получили разрешение к использованию для лечения канцерогенных заболеваний [960]. Имеются также моноклональные антитела, используемые для лечения сердечнососудистых заболеваний, воспалительных процессов, дегенерации сетчатки, отторжения трансплантантов, рассеянного склероза, вирусной инфекции и др. [961]. В то же время, комплексы антител с липосомами, иммунолипосомы, пока еще не разрешены к использованию в медицине, хотя некоторые препараты находятся на ранних стадиях клинических испытаний [926].

121

3.4.2. Адресация иммунолипосом

В настоящее время широко исследуется возможность использования иммунолипосом для доставки лекарств к различным типам тканей для лечения разнообразных заболеваний. Способность иммунолипосом специфически связываться с клетками-мишенями может стать основой их широкого применения в медицине. Для нацеливания иммунолипосом на патологически измененные клетки очень важно использование высоко специфических антигенов, присутствующих только на поверхности кле- ток-мишеней, что позволило бы отличать их от клеток здоровых тканей. Сейчас идентифицировано большое разнообразие специфических антигенов и получены соответствующие моноклональные антитела, которые можно использовать для адресации липосом. Так, для адресации липосом к клеткам семенников предложено использовать антитела к лактат дегидрогеназе С4 [962], а для адресации к клеткам простаты можно использовать моноклональные антитела 5D4 [963]. Для атаки клеток карциномы прямой кишки мишенью может служить гликопротеин TAG-72, сверхэкспрессия которого наблюдается в данном типе клеток [964]. Для этих целей были разработаны рН чувствительные, модифицированные PEG иммунолипосомы диаметром около 90 нм, содержащие гемцитабин (gemcitabine) – агент, тормозящий пролиферацию клеток опухоли. Липосомы способны высвобождать этот агент при снижении рН до 5,5, наблюдаемом при эндоцитозе липосом в клетку и доставке к лизосомам [965]. Для доставки липосом к мезангиальным клеткам почечных клубочков используются липосомы с антителами к Thy 1.1 [966]. Антитела к антигену VCAM-1 позволяют направлять иммунолипосомы с лекарством к клеткам кровеносных сосудов опухоли [967]. Для адресации липосом к сó лидным опухолям молочной железы можно использовать антитела против Е- селектина (E-selectin), сверхэкспрессия которого наблюдается после проведения радиационной терапии [968]. Этот вид адресации называют ра- диационно-направляемым (radiation guided targeting). Для адресации липосом к клеткам обонятельного эпителия можно использовать антитела к белку GFAB, что может помочь в доставке агентов, способных стимулировать регенерацию аксонов соответствующих нервных клеток [969].

Проникновение антител внутрь опухоли зависит от многих факторов, таких как поверхностный заряд, липидный состав и размеры липосом. Например, проникновению в опухоль катионных липосом может препятствовать наличие электростатического барьера [970]. Предполагается, что само наличие антител на поверхности липосом может стать своеобразным препятствием для проникновения липосом вглубь опухоли, поскольку иммунолипосомы обнаруживают тенденцию активно взаимодействовать с клетками опухоли на периферии [926]. Для преодоления этих препятст-

122

вий можно подобрать подходящие катионные липиды, использовать также липиды, способствующие слиянию мембран, например фосфатидилэтаноламин, или стерическую стабилизацию липосом [971]. Проникновению в опухоль липосом с доксорубицином могут способствовать и такие факторы, как радиотерапия [972].

Известно, что наночастицы, включая липосомы, способны скапливаться в опухолях, воспалениях, абсцессах и в областях некоторых видов повреждений тканей за счет повышенной проницаемости сосудов опухоли для частиц наноразмеров. Наличие антител на поверхности иммунолипосом не приводит к существенному увеличению их концентрации в этих областях по сравнению с аналогичными липосомами без антител. Фармакокинетика иммунолипосом подчиняется тем же законам, что и обычных липосом, не содержащих антител на поверхности. Улучшенная антиопухолевая активность иммунолипосом определяется различиями их локализации внутри опухоли и характером взаимодействия с отдельными клетками [938,939,973]. Было показано, что иммунолипосомы способны эффективно проникать в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Эндоцитироваться могут более 90% иммунолипосом, тогда как аналогичные липосомы, не содержащие антител подлежат эндоцитозу менее чем на 5% [938]. При этом общая концентрация липосом в опухоли не зависела от присутствия антител. Таким образом высокая эффективности иммунолипосом с доксорубицином объясняется доставкой этого вещества непосредственно в цитоплазму. Предполагается, что доставка лекарственных веществ с помощью иммунолипосом осуществляется в две стадии. Вначале, стерически стабилизированные липосомы медленно накапливаются в опухолевой ткани, достигая высоких концентраций благодаря эффекту повышенной проницаемости и удержания (ППУ). Для этого процесса, очевидно, не требуется взаимодействие антиген-антитело и преимущества иммунолипосом никак не проявляются на этом этапе, но взаимодействие иммунолипосом с поверхностью клетки активирует следующую стадию – интернализацию липосом в клетку посредством эндоцитоза, а также дальнейшее разрушение липосом и высвобождение лекарства в цитоплазму.

Скорость высвобождения лекарственного вещества из липосом имеет большое значение. Эта скорость может зависеть, как от липидного состава липосом, так и от свойств самого лекарственного вещества. Так, высвобождение доксорубицина из липосом, образованных смесью фосфатидилхолина и холестерина, зависело от длины и степени насыщенности жирных кислот, входящих в состав фосфатидилхолина [738]. Была обнаружена сложная зависимость между терапевтическим эффектом, токсическим действием и скоростью высвобождения лекарства, которая сильно различалась для липосом разного состава (полупериод выхода Т1/2 варьировал то 2ч до 315ч). При этом липосомы с наименьшей скоростью

123

выхода лекарства оказывали наибольший терапевтический эффект и наименьшую токсичность. Очевидно это связано с тем, что данные липосомы сохраняли лекарство в течение всего периода циркуляции в крови вплоть до момента доставки к клеткам-мишеням. Липосомы с наибольшей скоростью выхода лекарства также не были токсичны, хотя обнаруживали минимальный терапевтический эффект, очевидно, потому, что к моменту взаимодействия с клетками опухоли они теряли большую часть лекарства. Неожиданным оказалось то, что наибольшую токсичность проявляли липосомы со средней скоростью выхода лекарства.

Можно предположить, что плотность антигенов на поверхности клетки также будет оказывать существенное влияние на адсорбцию иммунолипосом. В экспериментах с иммунолипосомами, загруженными доксорубицином, и содержащими на поверхности антитела GAH и полиэтиленгликоль, изучались на 10-ти клеточных линиях с различной плотностью антигенов на поверхности [973]. Было показано, что при плотности антигенов выше 4х104 сайтов на клетку кривая зависимости выходит на плато и далее не меняется.

Альтернативным использованием иммунолипосом является адресация к клеткам неоваскулатуры (сосудистой системы) опухолей, а не самой опухолевой ткани [974]. В этом случае иммунолипосомы специфически связываются с антигенами эндотелиальных клеток капилляров опухоли. Предполагается, что нарушения кровоснабжения опухолей должно приводить к замедлению их роста. Для этого можно использовать антитела на эндоглин человека (human endoglin CD105) – антиген, ответственный за регуляцию пролиферации клеток эндотелия и процессы неоваскуляризации, что позволяет осуществлять эффективную адресацию к этим тканям иммунолипосом с доксорубицином или контрастным агентом [975,976].

3.4.3. Универсальные антигены опухолей

Выше были приведены примеры высоко специфичной адресации липосом к определенным типам опухолевых клеток. Однако существуют также потребность в создании универсального способа воздействия на различные виды опухолевых клеток независимо от их происхождения. Поиски универсальных антигенов, являющихся отличительной чертой поверхности различных опухолевых клеток представляют сложную задачу. Использование фрагментов ядер – нуклеосом, образующихся при апоптозе части клеток опухоли, является весьма изящным решением данной проблемы. В результате апоптоза фрагменты ядер, нуклеосомы, высвобождаются из разрушенных клеток. Нуклеосомы прикрепляются к специфическим рецепторам на поверхности соседних клеток опухоли, что делает

124

их хорошо различимыми для соответствующих антител. Здоровые клетки не содержат рецепторов к нуклеосомам и остаются «невидимыми» для соответствующих антител. Было показано экспериментально, что антитела против клеточных ядер ANA (Antinuclear Antibodies) специфически связывающиеся с нуклеосомами, способны распознавать клетки различных опухолей, не взаимодействуя с клетками здоровых тканей [948]. Например, моноклональные ANA-специфичные антитела 2С5 и 1G3 (Рис.13), полученные от здоровых мышей, эффективно отличают клетки различных опухолей от здоровых клеток [977,978]. Парадоксально, что созданный природой процесс мечения опухолевых клеток ядерными белками, позволяет этим клеткам избегать атаки клетками-киллерами иммунной системы хозяина [979], но в руках исследователей, этот процесс был использован против опухоли, поскольку меченные клетки оказались удобной мишенью для атаки с помощью иммунолипосом [980].

Рис.13. Адресация иммунолипосом к нуклеосомам, располагающимся на поверхности клеток опухоли. Показано, что (а) часть клеток опухоли обычно разрушается в результате апоптоза. Фрагменты ядер разрушенных клеток, нуклеосомы, выходят из клеток и адсорбируются на специфических рецепторах, присутствующих только на поверхности клеток опухоли, но не на здоровых клетках. Иммунолипосомы с лекарством, покрытые PEG и несущие антитела против нуклеосом (2С5 или 1G3) взаимодействуют с нуклеосомами на поверхности клеток опухоли, что инициирует эндоцитоз иммунолипосом (б), их доставку к лизосомам, где липосомы разрушаются, а лекарство высвобождается в цитоплазму.

3.4.4. Стратегия ADEPT

Одной из весьма перспективных стратегий использования иммунолипосом является терапия предшественниками лекарственных веществ

(ADEPT – antibody-directed enzyme prodrug therapy) которая предполагает

125

процедуру в три этапа [981-984]. Сначала осуществляется доставка к клеткам конъюгатов фермента и антитела (КАФ), полученных химической модификацией или с помощью генной инженерии (Рис.14). Далее, удаляют не связавшиеся КАФ из организма. На последнем этапе в кровь вводят предшественники лекарства (prodrugs), не обладающие токсичностью, присущей препаратам химиотерапии. При проникновении в опухоль, предшественники лекарства подвергаются атаке ферментами КАФ и переходят в активную токсичную форму, способную проникать в клетки опухоли и уничтожать их.

Рис.14. Стратегия доставки лекарственных веществ к опухолевым клеткам ADEPT. Вначале в кровь добавляют конъюгат антитела и фермента (КАФ), который взаимодействует с антигенами на поверхности опухолевой клетки (a). Затем, в кровь добавляют нетоксичный предшественник лекарственного вещества. Приближаясь к поверхности клеток опухоли, предшественник активируется с помощью фермента (б), после чего активная форма лекарства проникает не только в клетки опухоли, имеющие соответствующие антигены, но и находящиеся рядом клетки без антигенов

– клетки « свидетели» (bystanders). Это явление называется эффектом « свидетеля»

(bystander effect).

Преимуществом этой стратегии является снижение в сотни раз токсического действия лекарства на организм в целом. Например, можно использовать азотный иприт (nitrogen mustard) или фенол иприт (phenol mustard), которые слишком токсичны при введении в целый организм (Рис.15), но в случае локального действия на опухоль оказываются высоко эффективным лекарством [985], которое прошло начальные стадии клинического исследования [986].

Пока немногочисленные исследования показывают, что комбинация стратегии ADEPT с иммунолипосомами, загруженными лекарственным веществом, может быть весьма эффективной [981,987-989]. Так, доставка липофильного предшественника дипальмитоил-флуоро-деоксиуридина

126

Рис.15. Получение токсичного лекарства иприта фенола из нетоксичного предшественника

(FUdR-dP) к клеткам культуры аденокарциномы прямой кишки (СС531) с помощью иммунолипосом приводила к эндоцитозу липосом, высвобождению и последующему гидролизу FUdR-dP, которое превращается в активное лекарство FUdR. Для этих целей гибридный белок, состоящий из фермента, гидролизующего предшественник лекарства, и антитела IgG1 против клеток аденокарциномы прямой кишки крысы, был прикреплен непосредственно к поверхности иммунолипосом, или к дистальному концу молекулы PEG, находящейся на поверхности липосом . В результате, доставка лекарства FUdR возрастала в 30 раз по сравнению с липосомами без антител [987].

3.4.5. Иммунолипосомы в генной терапии

Исследования возможности использования иммунолипосом для направленной доставки генов к определенным клеткам (генная терапия) начались более 10-ти лет назад [990]. Используя катионные липиды можно создавать нековалентные комплексы плазмидной ДНК и антител путем простого смешивания с липосомами при незначительном подогреве, который способствовал агрегации иммуноглобулинов [991]. Используя антитела против рецептора трансферрина или Е-селектина, авторам исследования удалось трансфецировать клетки эндотелия. Более эффективным является использование scFv фрагментов антител, ковалентно прикрепленных к концам нитей PEG стерически стабилизированных липосом. Так, scFv фрагменты антител против рецептора трансферрина, обозначаемый как TsPLP-комплекс сравнивали в экспериментах in vitro и in vivo с ДНК-липидными комплексами (липоплексами), которые не были стабилизованы PEG или не содержали антител на поверхности [992-994]. Было обнаружено, что в экспериментах in vitro наибольшую эффективность обнаруживали липоплексы с антителами, но без PEG. Однако in vivo наибольшую эффективность проявляли липоплексы с антителами и стабилизированные PEG. Очевидно, что присутствие PEG на поверхности липоплексов снижает эффективность трансфекции, что проявляется в условиях

127

экспериментов in vitro, где присутствие PEG не дает никаких преимуществ. Эти преимущества проявляются в экспериментах in vivo, поскольку наличие PEG на поверхности липоплексов существенно увеличивает время их циркуляции в крови и доставку к клеткам-мишеням. Аналогичные эксперименты с TsPLP-комплексами были проведены также в экспериментах по доставке антисмысловых полинуклеотидов [922,995] и короткой интерференционной РНК [996].

3.4.6. Доставка контрастеров

Исследуется также возможность использования иммунолипосом для доставки контрастеров, необходимых для визуализации патологических процессов с помощью магниторезонансной томографии (MRI – Magnetic Resonance Imaging) или гамма-радиосцинтиграфии [938,939,948,9971001]. Для целей MRI контрастные металлы (Gd) переводят в водорастворимое состояние посредством инкапсулирования в водорастворимые хелаторы [1002] или, наоборот, хелатор гидрофобизируют, прикрепляя к молекуле фосфолипида (фосфатидилэтаноламина) и встраивая полученный комплекс в липосому [1003]. Такой подход часто называют «якорением» (anchoring). Кроме того, в липосомы можно загружать халатирую-

щие полимеры РАР (polychelating amphiphilic polymers). Полимер можно прикрепить к липиду и встроить в бислой липосомы. В результате, к одному якорю прикрепляется много молекул металла (Gd), что увеличивает контраст [1001,1004]. Аналогичные приемы использовали для адресации иммунолипосом, загруженных изотопом 111In[947,948] которые применяются в гамма-сцинтиграфии для визуализации различных видов опухолей. Исследовали также адресациию липосом, загруженных изотопами 212Bi, 225Ас, 223Ra, которые являются источниками α-частиц, и могут использоваться для высоко точной лучевой терапии [956,1005,1006].

3.4.7. Заключение

Предполагается, что иммунолипосомы найдут широкое применение в клинической практике, хотя исследования в этой области находятся на ранней стадии. Было проведено клиническое исследование (1-я фаза) иммунолипосом стерически стабилизированных с помощью PEG, нагруженных доксорубицином, содержащими F(ab’)2 фрагменты моноклональных антител человека, обладающие высокой специфичностью к опухолям желудка. Были определены допустимые дозы, показано отсутствие токсичности доксорубицина, заключенного в липосомы, определена фармакокинетика. Хотя не было обнаружено выраженной антиопухолевой активности, у значительной части пациентов наблюдалась стабилизация заболевания [1007,1008].

128

Глава 4

Интеллектуальные липидные наноконтейнеры

4.1. Общие принципы конструирования

Наночастицы, служащие контейнерами для доставки лекарственных веществ в организм человека, должны обладать рядом важных свойств. Они должны длительное время циркулировать в русле крови, удерживая заключенные в них вещества. Желательно, чтобы они обладали способностью распознавать клетки, на которое направленно терапевтическое воздействие и накапливаться рядом с ними, или прикрепляться к их поверхности, или проникать внутрь этих клеток для доставки веществ к определенным внутриклеточным компартментам. Кроме того, при достижении цели на поверхности или внутри клеток, наноконтейнеры должны обладать способностью высвобождать содержимое со строго контролируемой скоростью и в соответствии с терапевтическими требованиями или физиологическими потребностями организма [213,215,927,1009-1011].

Как обсуждалось в предыдущем разделе, для длительной циркуляции в русле крови поверхность наноконтейнеров покрывают гидрофильными полимерами, например ПЭГ, что придает частицам свойства невидимости для клеток ретикулоэндотелиальной системы (Рис.1). К молекулам полимеров или непосредственно к поверхности частиц могут быть прикреплены антитела или рецепторы, придающие частицам способность распознавать клетки-мишени. В липидном бислое могут находиться также молекулы, чувствительные к внешним стимулам, включая изменение температуры, кислотности или присутствие определенных молекулярных агентов. Предполагается, что изменение параметров среды должно инициировать фазовые переходы амфифилов, что должно способствовать высвобождению лекарственных веществ. Во внутреннем водном пространстве или в гидрофобной области контейнеров могут присутствовать также различные метки, позволяющие следить за перемещением частиц в организме. Кроме того, внутри частиц могут находиться магнитные шарики, позволяющие влиять на перемещение контейнеров с помощью внешнего магнитного поля.

Предполагается, что существуют некие общие принципы конструирования наноконтейнеров, позволяющие им адекватно реагировать на изменение параметров окружающей среды [1012-1014]. Величина гидрофобного/гидрофильного баланса является фактором, который наиболее