59
недостаточность в стадии декоменсации, острая дыхательная недостаточность,
почечная недостаточность, цирроз печени в стадии декомпенсации.
Пациенты в ходе исследования были разделены на 4 группы, в зависимости от времени достижения максимальной нуклеазной активности плазмы (точка max
1,5 ч; 3,0 ч; 4,5 ч; 6,0 ч) после проведения ингаляции дорназы альфа. Клинико-
демографические параметры пациентов каждой из 4 подгрупп представлены в Таблице 14.
Таблица 14 – Характеристика группы пациентов с МВ в исследовании фармакокинетики дорназы альфа
2.2. Методы исследования
Для создания РП с МВ СФО ретроспективному анализу были подвергнуты выписки из амбулаторных карт и стационаров. Оценивали следующие клинические данные: возраст установления диагноза, уровень хлоридов и электролитов пота при проведении потового теста, наличие легочных и внелегочных осложнений, функция внешнего дыхания (у пациентов старше 5 лет в соответствии с критериями ERS/ATS), функция поджелудочной железы на основании клинических симптомов (наличие или отсутствие видимой стеатореи),
60
результатов копрограммы и/или фекальной эластазы-1 кала согласно проекту национального консенсуса “Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия” 2016 [1]. Информация о каждом пациенте включала в себя также объем проводимой медикаментозной и немедикаментозной терапии,
сведения о проведенных трансплантациях печени, легких. Специалисты,
работающие с больными МВ в регионах, вносили сведения о пациентах в общую для всех электронную форму, разработанную рабочей группой Европейского регистра по МВ (https://www.ecfs.eu/ecfspr) и используемую при заполнении данных для Проекта Регистра больных МВ РФ (https://mukoviscidoz.org
/mukovistsidoz-v-rossii.html). В качестве сравнения приводили данные Регистра пациентов с МВ в РФ, 2017 год [46].
2.3.1. Молекулярно-генетические исследования
Генетическое исследование – поиск патогенных генетических вариантов МВ было выполнено в региональных генетических центрах и/или в ФГБН
«МГНЦ». Название мутаций вносили соответственно международной базе данных СFTR1 и СFTR2 (http://www.genet.sickkids.on.ca, https://cftr2.org/).
Аллельная частота определена для всех обнаруженных мутаций. Оценивалась
«тяжесть» генотипа. Для «тяжелого» генотипа обязательно наличие мутации I–III
класса на 2 хромосомах, для «мягкого» генотипа необходимо наличие хотя бы 1
мутации IV–V класса» [292]. Информация о CFTR генотипе российских пациентов взята из Российского Регистра пациентов с МВ 2017 года, архивов лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ» и НИИ медицинской генетики г. Томска.
Данные о генотипе ферментов биотрансформации ксенобиотиков 1-й и 2-й
фаз (ФБК 1-й и 2-й фаз) взяты из амбулаторных карт пациентов, обследованных аспирантом научно-клинического отдела муковисцидоза Новоселовой О. Г.
Материалом исследования являлась «тотальная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови стандартным методом. Изучение полиморфизма генов ФБК проводили методом ПЦР и последующего ПДРФ (полиморфизм длин
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
61
рестрикционных фрагментов) или ПДАФ (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов) анализа с использованием праймеров,
выбранных для исследования [290].
Гены и полиморфные варианты, выбранные для исследования представлены в таблице 5
Таблица 15 – Исследуемые полиморфизмы генов биотрасформации 1-й и
2-й фаз
В работе были использованы следующие «реактивы, ферменты и биопрепараты: акриламид (АА), бис-акриламид (БАА), борная кислота,
двунатриевая соль диамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА), гидроксид натрия,
персульфат аммония, тетраметил-этилендиамин (TEMED), масло минеральное,
хлорид магния, сульфат аммония, Twin-20, хлорид натрия, бромид этидия,
ксиленцианол, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ООО «Хеликон», Россия), GeneRulerTM50п.н. ДНК маркер (“Fermentas”, Литва); ферменты: Taq-полимераза
(ООО «Хеликон», Россия); эндонуклеазы рестрикции AspS9I, BamHI, BstDEI, BstMAI, DraIII, EcoRV, FaeI, FokI, HhaI, KpnI, MspI, MvaI, NcoI, TaqI,
(“Fermentas”, Литва); наборы для выделения ДНК («Promega», США);
олигонуклеотидные праймеры (ООО «Евроген», Россия).
Выделение геномной ДНК пациентов проводили из лейкоцитов венозной крови с использованием набора реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit»
фирмы «Promega» (USA) в соответствии с рекомендациями производителя» [290]. «Анализ полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков проводили методом ПЦР с последующей рестрикцией
62
специфическими эндонуклеазами (ПДРФ), либо прямым анализом длин амплифицированных фрагментов ДНК (ПДАФ) при разделении в результате гель-
электрофореза. Амплификацию фрагментов геномной ДНК (0,5–1мкг) проводили в 20 мкл реакционной смеси (67mM Tris (pH8,4), 2mM MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4, 20 г/мл BSA), содержащей по 200 М каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата,
по 10 pM каждого праймера и 1,5 е.а. Taq-полимеразы. Последовательности праймеров для анализа вариантов генов CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, GSTP1, NAT2, GSTP1, GCLC (VNTR) разработаны Новоселовой О. Г. совместно с Петровой Н. В. (ФГБНУ «МГНЦ»), для анализа делеционного полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 и вариантов GCLC (-129C> T) и GCLM (-588C> T)
использованы праймеры, последовательности которых приведены в литературе»
[290, 245].
Тестирование вариантов генов CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, GSTP1, NAT2, GSTP1, GCLC (c.-129C> T) и GCLM проводили методом ПДРФ анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).
Для исследования вариантов генов CYP2C9 (1075A>C; I359L), CYP2C19
(636G> A; W212X), CYP2D6 (1846G> A), GSTP1 (c.313A>C), NAT2 (c.341T>C)
последовательность праймеров была изменена для создания сайта рестрикции соответствующих эндонуклеаз» [290].
«Наличие природных сайтов рестрикции для соответствующих эндонуклеаз позволило исследовать варианты генов CYP2C9 (c.430C>T; R144C), CYP2C19
(c.681G>A), CYP2D6 (1846G>A), CYP3A4 (c.1334T>C; M445T), NAT2 (c.191G>A, c.282C>T, c.434A>C, c.481C>T, c.590G>A, c.803A>G, c.845A>C, c.857G>A), GCLC
(c.-129C>T) и GCLM (c.-588C>T).
Разделение фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в 8%-м
ПАА-геле (АА: БАА – 29:1,3) в течение 1,5–2 часов при 400 В. Гель окрашивали бромистым этидием, визуализировали в УФ, документировали с использованием системы видеодокументации Vilber Lourmat (Франция).
Оценку размеров фрагментов проводили при сравнении с контрольными образцами известной длины» [290]. «Изучение делеционного полиморфизма
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/