Глава 2. Молекулярные маркеры и другие лабораторные показатели в диагностике злокачественных новообразований

Гистоморфологическое исследование по сей день остается краеугольным камнем диагностики, классификации и определения стадии злокачественных новообразований. В большинстве случаев для постановки диагноза и определения прогноза бывает достаточно световой микроскопии в сочетании с гистохимической окраской. Однако такое исследование отличается субъективностью и неточностью при оценке опухолей низкой степени дифференцировки, опухолей неизвестного первичного происхождения и необычных новообразований. В эпоху все более изощренных терапевтических режимов (зачастую направленных против молекулярных процессов, ведущих к образованию злокачественной опухоли) и в связи с необходимостью получать максимум информации из образцов, полученных минимально инвазивным путем (например, при пункционной биопсии или тонкоигольной аспирации) были разработаны дополнительные методы исследования, повышающие специфичность и воспроизводимость диагноза. В их основе лежит анализ экспрессии антигенов, специфичных для определенных клеток, и опухолеспецифических генетических изменений, что дает ценную диагностическую, прогностическую и/или терапевтическую информацию.

Таблица 2.2. Иммуногистохимическое исследованиев дифференциальной диагностике

Тип клеток	Промежуточные филаменты	Молекулярный вес или подтип	Наличие в опухолях
Эпителиальные	Цитокератины	40-67	Ороговевающие и неороговевающие карциномы
Мезенхимальные	Виментин	58	Широко распространены: саркомы, меланомы, многие лимфомы, некоторые карциномы
Мишечные	Десмин	53	Лейомиосаркомы, рабдомиосаркомы
Глиальные астроциты	Глиальеый фибриллярный кислый белок	51	Глиомы (включая астроцитомы), эпендимомы
Нейроны	Белки нейрофиламента	68,160; 200	Опухоли нервной ткани, нейробластомы

В большинстве случаев окраска моноклональными антителами, направленными против клеточных белков, в сочетании с иммунопероксидазным методом вытеснила прямое ультраструктурное исследование тканей, так как позволяет более точное различение опухолей эпителиального.мезенхимального, гематолимфатического, нейроэндокринного или мезенхимального, гематолимфатического, нейроэндокринного или глиального происхождения. Классический пример — иммуногистохимическое определение промежуточных филаментов, по-разному экспрессирующихся в разных клетках.

Таблица 2.2. Иммуногистохимическое исследованиев дифференциальной диагностике злокачественных новообразований

Опухоль	Кератин	Хромогранин синаптофизин	S100	MART-1	LCA	OCT 3\4	SMA/ десмин
Карцинома	+	-	-/+	-	-	-	-
Герминогенная опухоль	+\-	-	-	-	-	+/-	-
Лимфома	-	-	-	-	+	-	-
Меланома	-	-	+	+\-	-	-	-
Нейроэндокри- нная	+\-	+	-	-	-	-	-
Саркома	-/+	-	-/+	+/-	-	-	+/-

В табл. 2.1. приведены промежуточные филаменты, наиболее важные для диффсрснцировки клеточного происхождения опухолей. Цитокератины — сложное семейство полипептидов, экспрессирующихся в разных комбинациях в разных типах эпителиальных клеток. Антитела к подтипам цитокератина могут использоваться для определения эпителиального происхождения метастатической карциномы неизвестной первичной локализации. Например, для этой цели исследуется характер окраски антителами на цитокератин 7 (54 кДа), экспрессирующийся преимущественно в железистом и про-токовом эпителии и переходном эпителии мочевого тракта,и цитокератин 20 (46 кДа), экспрессия которого на этих клетках ограничена.

Помимо антител к промежуточным филаментам, доступны антитела и к другим клеточным и опухолевым антигенам.2 В последнее десятилетие достижения иммуногистохимии позволили внедрить повсеместное, надежное применение этой методики для исследования образцов тканей, полученных хирургическим путем.2 Этому способствовали техники повышения доступности антигенов (включая обработку протеоли-тическими ферментами и повышение доступности антигенов при термической обработке), появление чувствительных систем регистрации, автоматизация метода и разработка широкого спектра антител. В табл. 2.2. представлены некоторые антитела, которые могут рутинно использоваться для окрашивания парафиновых срезов тканей, фиксированных формалином, для диагностики низкодифференцированных новообразований. Дифференциальный диагноз основывается на морфологических и клинических особенностях, которые впоследствии могут быть подтверждены иммуногистохимическим исследованием. Важно помнить, что большинство антител не абсолютно специфичны для определения тканевого происхождения, и могут наблюдаться «аномальные» варианты окрашивания. Кроме того, возможны биологические варианты низкодифференцированных новообразований, с различными отклонениями в экспрессии антигенов. В связи с этим точность определения тканевого происхождения или первичной локализации опухоли достигается применением панели антисывороток. В табл. 2.3 представлен пример дифференциального диагноза на основании результатов иммуногистохимиче-ского исследования.

В то время как при отдельных онкологических заболеваниях исследование с помощью ряда моноклональных антител значительно помогает в диагностике, три злокачественных опухоли могут быть диагностированы при выявлении только одного высокоспецифичного белка. Папиллярные и фолликулярные карциномы щитовидной железы характеризуются иммунореактивностью к тиреоглобулину (синтезом/экспрес-

Таблица 2.3 Панель антител для дифференциальной диагностики аденокарциномы и мезотелинома

Опухоль	Кератин	WT-1	CD15(Leu-M1)	CEA
Аденокарцинома	+	-	+	+
Мезотелиома	+	+	-	-

Положительная окраска на кератин при определенных клинических особенностях опухоли затрудняет дифференциацию между аденокарциномой и мезотелиомой + положительная окраска — отрицательная окраска СЕА — carcinoembryonic antigen, раково-эмбриональный антигенсией тиреоглобулина), карцинома простаты выявляется в реакции на простатический специфический антиген, а рак молочной железы — по антигену GCDFP-15 (Gross cystic disease fluid protein), которые выявляются приблизительно в 50—70% случаев. Следует заметить, что последний антиген также вы­является при редкой карциноме апокриновой потовой железы. Не тканеспецифичные антигены, полезные для диагностики опухолей, включаютTTF-1 (аденокарцинома легкого), RCC (рак почки), CD117 (c-kit, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта) и CD31 (молекула адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток, при новообразованиях эндотелия сосудов). Иммунологическая окраска также помогает для выявления нормальной тканевой архитектуры и её нарушений при новообразованиях. Например, иммунологическая окраска на белок рбЗ (ядерный антиген, экспрессирующийся в миоэпите-лиальных клетках молочной железы и базальных клетках простаты) полезна для выявления протоковых/железистых структур без нормального миоэпителиального строения, основного признака инвазивных новообразований.

В то время как клеточные белки, экспрессирующиеся при определенных новообразованиях, важны для их диагностики, соматические мутации (то есть мутации, возникающие в генах не зародышевых тканей) играют центральную роль в развитии рака. Предполагается, что для наступления злокачественной трансформации требуется ряд различных мутаций в ключевых генах. Такими мутациями могут быть делеции, дупликации, точечные мутации и/или хромосомные транслокации в ДНК опухолевых клеток-предшественниц. Мутации поражают регуляцию клеточного цикла, дифференцировку клеток, апоптоз или взаимодействия клеток между собой или с внеклеточным матриксом. Разные опухоли имеют различные сочетания генетических нарушений, ведущих к клональной пролиферации клеток. Эти генетические нарушения, лежащие в основе биологии опухолей, также могут использоваться для диагностики опухолей и/или определения прогноза заболевания. Лучше всего это иллюстрируется на примере лейкозов и лимфом, при которых генетические транслокации ведут к образованию химерной мРНК и новых белков. Эти транслокации легли в основу классификации некоторых лейкозов, как, например, филадельфийская хромосома t(9;22)(q34;qll) при хроническом миелоидном лейкозе и t(15;17)(q22;qll— 21) при остром промиелоцитарном лейкозе.3 Замены одного нуклео-тида также могут быть важной особенностью некоторых онкогематологических заболеваний, например, мутация JAK2 V617F часто встречается при хронических миелопролифера-тивных расстройствах.4 Хотя генетические нарушения в карциномах обычно сложнее, чем простые замены отдельных нуклеотидов или хромосомные транслокации, простые хромосомные транслокации также часто встречаются в опухолях мягких тканях (и служат их признаком).

Общая оценка структурных цитогенетических изменений в опухоли возможна с помощью полного кариотипического анализа, требующего свежей жизнеспособной опухолевой ткани. В противоположность кариотипическому анализу, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH — fluorescent in situ hybridization) представляет собой метод направленного выявления генетических аномалий, который можно выполнять на интерфазных клеточных ядрах, полученных из замороженных или парафиновых срезов ткани. Методом FISH возможно выявлять характерные цитогенетические аномалии, дополняющие диагноз онкологического заболевания. Например, при саркоме Юинга проведение FISH-исследования позволяет выявить реаранжировку в гене EWS; в таком случае наблюдается «расщепление» сигнала (см. рис. 2.1). Кроме того, были клонированы и секвенированы многие цитогенетические аномалии, характерные для злокачественных опухолей, что позволяет использовать молекулярно-биологические методики, как, например, блоттинг по Саузерну или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для этих методов возможно использование свежей или замороженной опухолевой ткани или даже зафиксированной в парафине опухоли (в случае ПЦР), и их применение повышает точность диагноза за счет опре­деления характерных хромосомных транслокаций на молекулярном уровне. При проведении ПЦР исследуемая транслокация может быть выявлена в 1 из 100 ООО или даже в 1 из 1 ООО ООО клеток, в то время как для метода FISH этот показатель составляет 1 из 100 клеток. Таким образом, ПЦР представляет собой чувствительный метод диагностики и оценки ответа на лечение. Например, для хронического миелоидно-го лейкоза характерна транслокация t(9;22)(q34;ql 1), при которой происходит слияние генов BCR и ABLI и образование уникальной химерной мРНК, которую можно выявить с помощью техники количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. На основе имеющейся в клетках периферической крови РНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ОТ) производится синтез кДНК. Полученная в итоге кДНК химерного гена BCR-ABL1 оценивается количественно с помощью флуоресцентно-меченого олигонуклеотида, специфически гибридизирующегося с целевой кДНК в каждом цикле амплификации (см. рис. 2.2). Клинические исследования тирозинкиназного ингибитора иматиниба позволили определить минимальный остаточный уровень BCR-ABL1 РНК, сопровождающийся увеличением безрецидивной выживаемости (см. рис. 2.3).7'8 Повышение уровня BCR-ABL1 мРНКу больных, получающих ингибиторы тирозинкиназы, или у больных после трансплантации (костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток) указывает на молекулярный рецидив и необходимость альтернативного или дополнительного лечения. С помощью блоттинга по Саузерну или ПЦР возможно также выявлять клональные реаранжировки в генах иммуноглобулинов или Т-клеточного рецептора в качестве дополнения к диагнозу лимфомы или лейкоза (см. рис. 2.4).

Генетические исследования опухолей дают также информацию о прогнозе заболевания, как, например, выявление реаранжировки BCR-ABL1 при остром лимфобластном лейкозе с филадельфийской хромосомой. Кроме того, генетические исследования играют все возрастающую роль в планировании лечения по мере разработки терапевтических методов, направленных против определенных генетических нарушений. Примерами таких нарушений служат амплификация гена HER2 при раке молочной железы9 и мутация в гене рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) при раке легкого.1011 Подобные генетические нарушения возможно зарегистрировать по экспрессии аномальных белков (так иммуногистохи-мически фиксируется гиперэкспрессия онкобелка HER2 на поверхности клеток рака молочной железы), по амплификации гена (например, анализ гена HER2 методом FISH) или с помощью молекулярного анализа (например, исследование на точечные мутации или малые делеции гена EGFR при раке легкого, см. рис. 2.5). Количественное исследование уровня экспрессии большого числа генов при определенных новообразованиях с помощью олигонуклеотидных или кДНК-биочипов привело к идентификации ряда генов, имеющих прогностическую ценность (например, при диффузной круп­ноклеточной В-клеточной лимфоме, см. рис. 2.6).'2С помощью метода ОТ-ПЦР стало легкодоступным исследование уровня экспрессии множества генов на материале из приготовленных по стандартной методике парафинизированных образцов ткани. Например, разработана тест-система для исследования ряда генов, указывающих вероятность рецидива у больных раком молочной железы без метастазов в лимфатические узлы, получавших тамоксифен.13 С помощью этого диагностикума определяется уровень экспрессии генов, ответственных за ключевые процессы опухолевой биологии — пролиферацию, инвазию и ответ на эстрогены.

Количественные результаты исследования могут быть использованы для планирования терапии. Экспрессия генов и соответствующих белков может быть определена и обычными иммуногисто-химическими методами. Важным практическим примером такого подхода служит разработка антител против P504S (AMACR/рацемаза), белка, стойко экспрессирующегося при аденокарциноме простаты и интраэпителиальной нео-плазии простаты, но не в нормальном эпителии простаты.14 Иммуногистохимическая окраска становится благодаря этим антителам полезной для подтверждения диагноза аде-нокарциномы простаты в тех случаях, когда морфологиче­ская картина неоднозначна — например, при диагностике аденокарциномы небольших размеров на материале, полученном при пункционной биопсии.

Генетика злокачественных новообразований занимается также вопросами наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, описанной у ряда семейств.15 Известны синдромы, связанные с наследственными мутациями опухолевых супрессоров, например, семейная рети-нобластома, и мутациями в генах, ответственных за репарацию ДНК, например, при атаксиителеангиэктазии или синдроме Линча (наследственном раке толстой кишки без полипоза). Некоторые из этих синдромов приведены в таблице 2.4.

Таблица 2.4 Примеры наследственных синдромов, предрасполагающих к злокачественным новообразованиям

Синдром	Хромосомный локус	Ген
Атаксия-телеангиэктазия	11q22	ATM
Наследственный рак яичноков/	17q21	BRCA1
Молочной железы	13q12	DRCA2
Аденоматозный полипоз толсто ишки	5q21-q22	APC
Семейная форма ретинобластомы	13q14	RB1
Синдром Линча (наследственный рак толстой кишки без полипоза)	2p22-p21 3p21 2q31-q33 7p22	MSH2 MLH1 PMS1 PMS2
Синдром Ли- Фраумени	17p13	TP53
Множественная эндокринная неоплазия тип 1	11q13	MEN1
Множественная эндокринная неоплазия тип 2	10q11,2	RET
Нейрофиброматоз тип 1	17q11	NF1
Нейрофиброматоз тип 2	22q12	NF2
Болезнь Гиппеля- Линдау	3р26-р25	VHL