6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой
.pdfКнига 11. Флуоресцентные методы в медицине.
Краевой Сергей Александрович
Колтовой Николай Алексеевич
Москва
2014
1
Сведения об авторах:
Краевой Сергей Александрович, д.м.н. заместитель министра здравоохранения РФ.
Окончил Военно-медицинскую Ордена Ленина Краснознаменную Академию им. С.М. Кирова. Дополнительное образование:
повышение квалификации - МВА. «Каскадное обучение системе менеджмента качества и лидерства. Уровень «Руководитель качества».
Российская Академия Государственной службы при Президенте Российской Федерации «Социально-экономическая политика государства и пути ее реализации в здравоохранении». Российская Академия путей сообщения ФГБ ОУ ВПО МИИТ «Охрана труда на предприятиях железнодорожного транспорта» Дипломатическая академия Министерства Иностранных Дел Российской Федерации «Деловой протокол и этикет».
Институт усовершенствования врачей ФГУ «Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России «Организация здравоохранения и общественное здоровье».
«НМХЦ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России программа «Организация здравоохранения и общественное здоровье»
Колтовой Николай Алексеевич (Москва) - окончил МФТИ с отличием, кандидат физикоматематических наук. Много лет проработал в представительстве фирмы Zeiss в Москве, председатель “Image Processing Club”. Специализация - оптика, микроскопия, системы анализа изображений, исследование биожидкостей, спектральные методы исследования в медицине, спектральные методы ранней диагностики рака, кристаллизация биожидкостей.
koltovoi@mail.ru
2
С.Краевой, Н.Колтовой Книга 11. Флуоресцентные методы в медицине
Аннотация.
Книга посвящена актуальному и интересному методу - флуоресцентные методы в медицине. Важным преимуществом автофлуоресцентных методов является оперативность и отсутствие расходных материалов. Исследуется собственная флуоресценция самих объектов - крови и тканей. Рассматривается история применения флуоресцентных методов для диагностики различных заболеваний. Приводится обзор работ по различным направлениям флуоресцентной диагностики. Книга предназначена для специалистов, занимающихся изучением и разработкой новых методов диагностики - медиков, биологов, научных работников.
Серия книг по кристаллизации биожидкостей и спектральным методам.
Книга 1.Кристаллизация сыворотки крови методом открытой капли (угловая дегидратация). Книга 2.Кристаллизация сыворотки крови методом закрытой капли (краевая дегидратация). Книга 3. Тезиография. Кристаллизация тестовых растворов.
Книга 4. Кристаллизация различных биожидкостей.
Книга 5. Обзор литературы по кристаллизации биожидкостей. Книга 6. Структура и свойства воды.
Книга 7. Замораживание жидкостей.
Книга 8. Методы контрастирования в микроскопии. Книга 9. Спектральные методы в микроскопии.
Книга 10. Флуоресцентные методы. Хемилюминесценция. Книга 11. Флуоресцентные методы в медицине
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
S. Kraevoy, N. Koltovoy
Book 11. Biomedical applications of fluorescence.
Abstract.
The book is devoted to relevant and interesting method - fluorescent methods in medicine. An important advantage of autofluorescence methods is efficiency and lack of supplies. We study the intrinsic fluorescence of the objects themselves - the blood and tissues. Examines the history of the use of fluorescence techniques for the diagnosis of various diseases. Provides an overview of activities in different areas of fluorescent diagnostics. The book is intended for professionals involved in the study and development of new methods of diagnosis - doctors, biologists and scientists.
Books about the problems of crystallization bioliquids and spectroscopy. Book 1. Crystallization of blood serum by means open drops evaporation. Book 2. Crystallization of blood serum by means closed drops evaporation. Book 3. Sensitive Cristallization. Crystallization test solutions.
Book 4. Crystallization of different bioliquids.
Book 5. Review of the literature on the crystallization bioliquids. Book 6. The structure and properties of water.
Book 7. Freezing liquids.
Book 8. Contrast Methods in microscopy. Book 9. Spectral Methods in microscopy. Book 10. Fluorescence. Chemiluminescence.
Book 11. Biomedical applications of fluorescence.
3
Оглавление.
Введение
Глава 1. Эндогенные флуорофоры. 6
1.1Введение. 6
1.2Флуоресценция белков. 7
1.2.1Флуоресценция ароматических аминокислот. 7
1.2.2Альбумин (274, 348). 15
1.2.3Флуоресценция соединений альбумина с различными веществами. 20
1.2.4Флуоресценция иммуноглобулинов. 22
1.2.5Зависимость флуоресценции от различных условий. 22
1.2.6Зависимость флуоресценции от времени. Фосфоресценция. 33
1.2.7Литература по флуоресценции белков. 38
1.3Флуоресценция порфиринов. 43
1.4Различные эндогенные флуорофоры. 50
Глава 2. Флуоресценция крови. 79
2.1Эндогенные флуорофоры в крови - автофлуоресценция крови. 79
2.1.1Автофлуоресценция сыворотки крови. 79
2.1.2Зарубежная литература по автофлюоресценции сыворотки крови. 104
2.1.3Автофлуоресценция клеток крови. 107
2.1.4Зарубежная литература по автофлюоресценции клеток крови. 111
2.1.5Регистрация автофлуоресценции клеток с помощью проточной цитофлуорометрия.
116
2.2Экзогенные флуорофоры в крови - индуцированная флуоресценция крови. 120
2.2.1Флуорофоры для фотодинамической терапии. 122
2.2.2Флуоресценция лекарств в крови. 122
2.2.3Окраска препаратов с помощью акридинового оранжевого. 123
2.2.4Окраска препаратов различными флуорохромами. 125
2.3Флуоресценция крови для диагностики рака молочной железы. 128
2.4Изменение свойств крови при онкологических заболеваниях. 129
2.5Флуоресцентный метод выявления следов крови. 131
4
Глава 3. Флуоресценция тканей. 132
3.1Флуоресценция эндогенных флуорофоров тканей - автофлюоресценция тканей. 132
Оптическая биопсия (Optical Biopsy, Optical touch pointer)
3.1.1Отечественные работы по автофлюоресценции тканей. 136
3.1.2Зарубежные работы по автофлюоресценции тканей. 148
3.1.3Различные применения флуоресцентной диагностики тканей. 155
3.1.3.1Флуоресцентные методы исследования тканей. 155
3.1.3.2Флуоресцентные методы в эндоскопии. 162
3.1.3.3Стоматология. 166
3.1.3.4Исследование носа и глотки - оториноларингология. 170
3.1.3.5Автофлуоресценция в офтальмологии. 171
3.1.3.6Флуоресценция цервикса. 173
3.1.3.7Диагностика заболеваний микробной природы. 180
3.1.4Автофлюоресценция клеток. 182
3.2Флуоресценция экзогенных флуорофоров в тканях - индуцированная флуоресценция тканей. Фотодинамическая диагностика и терапия. 184
3.2.1Порфирины в тканях. 186
3.2.2Различные экзогенные флуорофоры (сенсибилизаторы) в тканях. 189
3.3ИК-флуоресценция для диагностики онкологических заболеваний. 203
3.4Флуоресценция ткани при раке молочной железы. 208
3.5Комплексы для флуоресцентной диагностики тканей. 211
Глава 4. Флуоресценция различных биожидкостей. 218
4.1Флуоресценция эндогенных флуорофоров в моче. 218
4.2Зарубежная литература по флуоресценции мочи. 220
4.3Флуоресценция экзогенных флуорофоров в моче. 225
4.4Флуоресценция слюны. 227
Литература по применению флуоресцентных методов в медицине. 228
5
Глава 1. Флуоресцентные методы в медицине.
1.1 Введение
Флуоресцентные методы уже давно применяются в медицинской диагностике, и являются очень эффективными при диагностике различных заболеваний. Флуоресцентный метод состоит в наблюдении флуоресценции препарата при возбуждении его ультрафиолетовым светом. Основной вклад во флуоресценцию вносят белки, которые светятся голубым светом. Можно выделить несколько этапов в применении флуоресцентных методов, несколько уровней глубины исследований.
1-Цвет. На первом этапе исследовалась флуоресценция различных объектов, и флуоресценцию оценивали по цвету флуоресценции - голубая, желтая, зеленая.
2-Спектр. На втором этапе регистрировался спектр флуоресценции. Это позволило боле объективно оценивать флуоресценцию.
3-Сравнение спектров флуоресценции при возбуждении объекта различными длинами волн. 4-Двумерный спектр. Регистрируется двумерный спектр флуоресценции. Это позволяет исследовать многокомпонентные спектры, когда ткань или биожидкость содержит различные флуорофоры.
5-Более точную диагностику различных заболеваний производят на основании регистрации и анализа синхронного спектра.
В абсорбционных спектральных методах изучаются спектры поглощения веществ на различных длинах волн. При флуоресцентной спектроскопии изучают спектры свечения (флуоресценции), возбуждаемой светом. При флуоресценции длина волны излучаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света.
Условно можно выделить следующие типы собственной флуоресценции: 1- Возбуждение - ультрафиолетовый свет, свечение - видимый свет.
2- Возбуждение - видимый свет, свечение - инфракрасный свет.
Дальнейшим совершенствованием метода является использование поляризованного света. Если объект облучать поляризованным светом, то степень поляризации флуоресценции содержит информацию о структуре молекул.
6
1.2 Флуоресценция белков.
1.2.1 Флуоресценция ароматических аминокислот.
В 1956 году одним из первых в мире Владимиров Ю.А. совместно с Коневым С.В. и Литвиным Ф.Ф. в МГУ обнаружили и исследовали флуоресценцию белков, и показал возможности метода флуоресценции для изучения структурных перестроек в белковой молекуле. Таким образом, содержание белка можно определять и флуоресцентным методом. Белки имеют максимум поглощения на длине волн 280нм. Нуклеиновые кислоты имеют полосу поглощения в районе 260 нм. Наблюдалось свечение альбумина на длине волны 450 нм при возбуждении светом с длиной волны 380 нм.
Природными флуорофорами белков являются аминокислоты триптофан, тирозин, фнилаланин. Наиболее информативна триптофановая флуоресценция. Флуоресценцию белков обычно возбуждают в максимуме поглощения при 280 нм или больших длинах волн.
Рис. 1-1. Спектры поглощения ароматических аминокислот.
Рис. 1-2. Спектры поглощения ароматических аминокислот.
7
Рис. 1-3. Спектр поглощения ароматических аминокислот и BSA – бычьего альбумина.
Рис. 1-4. Спектры поглощения и флуоресценции фенилаланина (Phe), тирозина (Tyr) и
триптофана (Trp). Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 1999.
8
Рис. 1-5. Спектр поглощения и флуоресценции тирозина при рН=7
Рис. 1-6. Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот. 282 нм - Phe - фенилаланин, 303 нм - Tyr - тирозин, 348 нм - Try - триптофан
Рис. 1-7. Спектр флуоресценции человеческого сывороточного альбумина HSA и ароматических аминокислот: 1-спектр флуоресценции HSA, 2 - триптофана. 3 - смеси тирозина и триптофана, эквивалентной той, которая найдена для HSA.
9
Рис. 1-8. Спектры поглощения (1) и первые производные спектров поглощения (2) для триптофана (а), тирозина (б) и фенилаланина (в). Растворительвода, температура 10 градусов. Демченко А.П. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев. Наукова Думка. 1988.
277с.
Таблица 1-1. Параметры возбужденных состояний для ароматических кислот.
Фенилаланин – (260,282), Тирозин – (275,303), Триптофан – (287,248).
Анализ параметров собственной флуоресценции триптофана позволяет исследовать конформационные изменения в третичной структуре молекулы различных соединений: например, конформационные изменения миоглобина и миоглобинподобных молекул - апомиоглобина и комплекса апомиоглобина с протопорфирином І. Изучали также собственную флуоресценцию ЛПНП, модифицированных в результате аутоокисления. Выявлены увеличение доступности триптофанилов для тушителей флуоресценции (ионы цезия) и индуктивно-
10