6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой

2.1.1.4 Флуоресценция флавинов – (360,510).

Рис. 2-12. Двумерный спектр различных компонент: TRP - Tryptophan, Tyr - Tyrosine, Py - Pyridoxine, FA - Folic Acid, RF - Riboflavin.

1999 - Saud Arabia - King Saud University - Masilamani Vadivel

2011 - V. Masilamani. T. Vijmasi. M. AlSalhi. K. Govindarajan. A. p.Vijaya Raghavan. Ram Rathan Rai. Detection of cervical cancer by fluorescence emission and stokes' shift spectra of blood and urine.

Proc. SPIE 7895, Optical Biopsy IX, 78950A (February 16, 2011). doi:10.1117/12.874010.

Для диагностики онкологических заболеваний (цервикс) исследуется спектр синхронной флуоресценции крови и мочи со сдвигом длин волн 40 нм. Для спектра флуоресценции клеток крови вычисляется коэффициент I630/I580 - отношение флуоресценции нейтрального порфирина/основного порфирина. Это отношение равно 1 в норме и равно 3 при раке. Для

спектра флуоресценции плазмы крови I510/I470 - отношение флуоресценции флавин/NADH. Это отношение равно 0,2 в норме и равно 0,8 при раке.

2012 - Vadivel Masilamani. Mohamad Saleh AlSalhi. Trinka Vijmasi. Kanaganaj Govindarajan. Ram Rathan Rai. Muhammad Atif. Saradh Prasad. Abdullah S. Aldwayyan. Fluorescence spectra of blood and urine for cervical cancer detection. J. Biomed. Opt. 17(9), 098001 (Sep 06, 2012). doi:10.1117/1.JBO.17.9.098001

91

2012 – Al-Salhi, M, Al Mehmadi, A.M. Abdo, A.A. Pra sad, S. Masilamani, V. Diagnosis of Liver Cancer and Cirrhosis by the Fluorescence Spectra of Blood and Urine Technol Cancer Res Treat. 11, 345-351 (2012). DOI: 10.7785/tcrt.2012.500282

Рис. 2-13. Синхронный спектр флуоресценции плазмы крови в норме, гепатит В, гепатит С, цирроз и клеточная карцинома. Сдвиг по длинам волн 10 нм.

92

2.1.1.5 Флуоресценция эндогенных порфиринов в крови.

2007 – Lualdi M, Colombo A, Leo E, Morelli D, Vanne lli A, Battaglia L, Poiasina E, Marchesini R. (Italy, Milan) Natural fluorescence spectroscopy of human blood plasma in the diagnosis of colorectal

cancer: feasibility study and preliminary results. Tumori. 2007 Nov-Dec;93(6):567-71.+

Спеткрофотометр Model F-3000, Hitachi, диапазон регистрации 430-700 нм. Рамановский пик наблюдался на длине волны 474 для воды и 464 для ацетона. Анализировалась интенсивность пиков флуоресценции плазмы крови 510 и 623 нм – эндогенный порфирин, пра возбуждении 405 нм. Пики формируются рибофлавопротеид, витамины, билируюин, липопротеины и порфирины.

Рис. 2-14. Спектр флуоресценции плазмы крови в норме (сплошная) и при раке (пунктиная), возбуждение 405 нм.

1976 - Poh-Fitzpatrick MB, Lamola AA. Direct spectrofluorometry of diluted erythrocytes and plasma: a rapid diagnostic method in primary and secondary porphyrinemias. J Lab Clin Med 1976;87: 362–70.

1980 - Poh-Fitzpatrick MB. A plasma porphyrin fluorescence marker for variegate porphyria. Arch Dermatol 1980;116:543–7. Возбуждение 626 нм.

1982 - Longas MO, Poh-Fitzpatrick MB. A tightly bound protein porphyrin complex isolated from the plasma of a patient with variegate porphyria. Clin Chim Acta 1982;118:219–28.

1993 - Enriquez de Salamanca R, Sepulveda P, Moran MJ, Santos JL, Fontanellas A, Hernandez A. Clinical utility of fluorometric scanning of plasma porphyrins for the diagnosis and typing of porphyrias. Clin Exp Dermatol 1993;18:128–30.

1993 - Long C, Smyth SJ, Woolf J, Murphy GM, Finlay AY, Newcombe RG, et al. Detection of latent variegate porphyria by fluorescence emission spectroscopy of plasma. Br J Dermatol 1993;129:9–13.

1995 - Da Silva V, Simonin S, Deybach JC, Puy H, Nordmann Y. Variegate porphyria: diagnostic value of fluorometric scanning of plasma porphyrins. Clin Chim Acta 1995;238:163–8.

1996 – Nomura N, Zolla-Pazner S, Simberkoff M, Kim M, Sassa S, Lim HW. (USA) Abnormal serum porphyrin levels in patients with the acquired immunodeficiency syndrome with or without hepatitis C virus infection. Arch Dermatol. 1996 Aug;132(8):906-10.

93

2004 - Richard J. Hift, Brandon P. Davidson, Cornelis van der Hooft, Doreen M. Meissner, and Peter N. Meissner. Plasma Fluorescence Scanning and Fecal Porphyrin Analysis for the Diagnosis of Variegate Porphyria: Precise Determination of Sensitivity and Specificity with Detection of

Protoporphyrinogen Oxidase Mutations as a Reference Standard. Clinical Chemistry 2004; v. 50, p.915-923. Published February 19, 2004.+ Регистрировался спектр флуоресценции плазмы в диапазоне 580-650 нм, при возбуждении 405 нм. Пик флуоресценции 620 нм.

2007 - Lilia CC, Flavia ROS, Enia LC et al (2007) Study of blood porphyrin spectral profile for diagnosis of tumor progression. J Fluoresc 17:289–2 92. Флуоресценция порфиринов в крови регистрировалась на длине волны 630 нм.

2010 - De Goes Rocha, F. G. Barbosa Chaves, K. C. Gomes, C. Z. Campanharo, C. B. Courrol, L. C. Schor, N. Bellini, M. H. (2010). Erythrocyte Protoporphyrin Fluorescence as a Biomarker for Monitoring Antiangiogenic Cancer Therapy. Journal of fluorescence, 20(6), 1225-1231.

2010 – Vivian Regina Tristão, Fernando Felippe de C arvalho, Cinthia Zanini Gomes, Adriana Regina Miranda, Cíntia C. Vequi-Suplicy, Maria Teresa Lamy, Nestor Schor, Maria Helena Bellini

Study of Blood Porphyrin Spectral Profile for Diagnosis of Chronic Renal Failure.

Journal of Fluorescence. May 2010, Volume 20, Issue 3, p.665-669. Регистрировалась флуоресценция протопорфирина IX в эритроцитах в диапазоне 600-700 нм. Пик флуоресценции

– 635 нм.

-------------------------------------------------------------------------------------------

2010 – Brazil – UNIFESP – De Oliveira Silva

2010 - De Oliveira Silva, F. R. Bellini, M. H. Tristao, V. R. Schor, N. Vieira, N. D. Jr. & Courrol, L. C. (2010). Intrinsic fluorescence of protoporphyrin IX from blood samples can yield information on the growth of prostate tumours. Journal of fluorescence, 20(6), 1159-1165.

2010 - Fauaz, G. Miranda, A. R. Gomes, C. Z. Courrol, L. C. de Oliveira Silva, F. R. de Goes Rocha, F. C. Bellini, M. H. (2010). Erythrocyte Protoporphyrin Fluorescence as a Potential Marker of Diabetes. Applied Spectroscopy, 64(4), 391-395.

2011 – Silva FR1, Bellini MH, Nabeshima CT, Schor N , Vieira ND Jr, Courrol LC. (Brazil) Enhancement of blood porphyrin emission intensity with aminolevulinic acid administration: a new

concept for photodynamic diagnosis of early prostate cancer. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2011 Mar;8(1):7-13. doi: 10.1016/j.pdpdt.2010.12.006. Epub 2011 Jan 17. Возбуждние флуоресценции – 405 нм.

94

2.1.1.6 Диагностика туберкулеза по флуоресценции плазмы крови – пик (633,665).

При заболевании туберкулезом в крови увеличивается содержание порфиринов - продуктов жизнедеятельности микобактерий туберкулеза. При возбуждении светом с длиной волны 400 нм регистрируется флуоресценция на длине волны 665 нм.

2008 - Москва - ИОФ РАН

2008 – Алекскандров М.Т. Иванова М.А. Васильев Е.Н. Хоменко В.А. Гапоненко О.Г. Лазернофлуоресцентная медицинская технология исследования спектральных характеристик различных микобактерий и ее клиническая апробация. Лазерная клиническая биофотометрия.

М. Техносфера. 2008. с.460-477.+ 2009 - Васильев Евгений Николаевич. (Москва, ИОФ РАН) Повышение эффективности

лазерной диагностики объектов микробной природы. Диссертация кандидата физикоматематических наук. Москва. ИОФ РАН. 2009. 107с. В диссертации рассматривается вопрос диагностики заболеваний туберкулезом путем измерения флуоресценции плазмы крови. Регистрация спектра флуоресценции проводилась с помощью прибора «Спектролюкс».

Рис. 2-15. Спектры флуоресценции плазмы крови пациентов. 1,2 – больные туберкулезом, 3- легочные заболеваний, 4-здоровые. Возбуждение 532 нм.

2009 - Александров М.Т. Васильев Е.Н. Воропаева М.И. Гапоненко О.Г. Иванова М.А. Кузьмин Г.П. Макарова М.В. Милонич А.И. Хоменко В.А. Способ дифференциальной диагностики микробов и сложных аминокислот. Патент 2362145. 2009.+

2014 - Новый экспресс-метод разработан специалистами двух научных учреждений:

Хоменко Владимиром Александрович - ведущий научный сотрудник ЦНИИ туберкулеза РАМН (Санк-Петербург) доктором медицинских наук, Кузьмин Геннадий Петрович - доктор физико-математических наук, заведующий

лабораторией резонансных явлений Института общей физики РАН (Москва).

Вприборе метод воплотили в российском НПЦ НПБ «Спектролюкс» - в приборе «Спектролюкс-МБ». Верификация метода традиционными способами показала его высокую достоверность: 93,7 % на 12000 проб.

Луч лазера с длиной волны 632,8 нм проходит сквозь предварительно приготовленную плазму крови (ее делают центрифугированием) и возбуждает флуоресценцию порфиринов - продуктов жизнедеятельности микобактерии туберкулеза в активной фазе.

Вслучае массового обследования речь, конечно, не идет о диагностике, но любой первично обученный оператор получит на выходе помимо графика и одно конкретное число (коэффициент флуоресценции), по которому он уже сможет сказать о вероятности того, что пациент болен туберкулезом.

95

Прибор прошел клиническое тестирование в ЦНИИТ и Туберкулезной клинической больнице №7 г. Москвы. Главное применение их метод может найти даже не в специализированных клиниках (хотя некоторые разновидности туберкулеза, к примеру, туберкулез глаз, диагностируются новым методом исключительно точно). Главная примение для прибора - скрининг больших групп людей. Ведь пропускная способность одного аппарата - до 400 анализов в рабочий день. Дело в том, что в современном мире большое распространение получил туберкулез с лекарственной устойчивостью. А современные противотуберкулезные препараты - это сильнодействующие вещества, далеко не безвредные для организма. Традиционными методами устойчивость микобактерии к лекарствам выявляется лишь через 2,5-3 месяца - и все это время пациент получает препараты, которые ему вообще не помогают. Их метод позволяет заподозрить медикаментозную устойчивость туберкулеза за две-три недели.

Рис. 2.16. Диагностический комплекс «Спектролюкс-МБ».

2003 - Александров М.Т. Хоменко В.А. Проблема диагностики ВЛТ и пути ее решения на основе применения лазерной флуоресцентной экспресс-индикации заболеваний и процессов микробной природы. Костно-суставной туберкулез: Монография под ред. проф. Ю.Н. Левашева и проф. А.Е. Гарбуза. М. 2003. с.93-123.

2004 - Александров М.Т. Зайцева Т.А. Хоменко В.А. Обоснование применения метода лазерной флюоресцентной диагностики для определения чувствительности микробных ассоциаций к антимикробным препаратам. VII Моск. междунар. салон промышленной собственности

«Архимед-2004». М. 2004. с.10-16.

2004 - Хоменко В.А. Александров М.Т. Бажанов H.H. и др. Лазерно-флюоресцентный метод экспресс-индикации микроорганизмов при гнойно-воспалительных заболеваниях, дисбактериозах и другой патологии микробной этиологии. Лазерно-флюоресцентный метод экспресс-индикации: Сб. избранных работ ММА им. И.М.Сеченова и ЦНИИТ РАМН. М. 2004.

с.2-16.

96

2005 - Александров М.Т. Пашков Е.П. Хоменко В.А. Экспресс диагностика туберкулеза методом лазерной флюоресценции. Молекулярная медицина и безопасность: Материалы II междунар. конф. М. 2005. с.63.

2005 – Ллександров М.Т. Гапоненко О.Г. Хоменко В.А. Способ люминесцентной диагностики и/или качественной оценки состояния биологического объекта и устройство для его осуществления. Патент 2254372. 2005.+

2005 - Хоменко Владимир Александрович. Совершенствование диагностики и лечения больных костно-суставным туберкулезом. Диссертация доктора медицинских наук. Санкт-Петербург. 2005. Регистрация флуоресценции осуществлялась с помощью спектроанализатора «Спектролюкс-МБ». Возбуждение – лазер 633 нм. Флуоресценция регистрируется в диапазоне 300-1100 нм. Выявлен спектр флуоресценции микобактерий туберкулеза M.tuberculosis. Максимум флуоресценции – 665 нм.

Рис. 2-17. Спектр флуоресценции микобактерий туберкулеза. Возбуждение 633 нм.

Порфирины в сыворотке крови.

В сыворотке крови содержится копропорфирин.

При онкологии в крови появляется протопорфирин IX. ПП-С - протопорфирин в сыворотке, КП-С - копропорфирин в сыворотке, УП-С - уропорфирин в сыворотке,

В сыворотке наличие порфиринов считают несомненным фактом, хотя количественное их определение представляет большие трудности. Полагают, что порфирином сыворотки является копропорфирин. При ряде патологических состояний и при патологической порфирии удавалось обнаружить в плазме копропорфирин в сопровождении уропорфирина, а при свинцовой интоксикации также копропорфирин.

97

1974 - Добротина Н.А. Кривошеев Б.Н. Содержание и функциональная активность протеинов сыворотки крови и некоторые вопросы патогенеза дерматозов с нарушением порфиринового обмена. Вестн. дерматол. 1974. № З. с.42-48.

2.1.1.7 Флуоресценция иммуноглобулинов – 700 нм.

Применение синхронного сканирования позволяет определить соотношение двух основных белков в сыворотке крови.

A B

Рис. 2-18. Спектр альбумина (А) и спектр иммуноглобулина IgG (В).

Рис. 2-19. Слева-синхронное сканирование (смещение равно 60 нм), Справа-флуоресценция на длине волны 280 нм. Спектры альбумина (сплошная линия) и иммуноглобулина IgG (пунктирная линия) существенно различаются.

98

2.1.1.8 Различные методы исследования флуоресценции сыворотки крови.

1983 - Черницкий Е.А. Слобожанина Е.И. (Минск, Институт фотобиологии) Люминесценция сыворотки крови и диагностика некоторых заболеваний. Известия АН БССР. Серия биологическая. 1983. №5. с.61-66.

1999 - Райченок Тамара Флоровна (Минск, Институт физики) Свечение сыворотки крови человека в длинноволновой области спектра. ЖПС. 1999. т.66. № 3. с.433-436. Изучены спектры поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции цельной, а также разбавленной натрий-фосфатным буфером сыворотки крови человека. Получены временные характеристики длинноволнового свечения сыворотки. Оценен квантовый выход фоновой флуоресценции при возбуждении излучением с l возб = 500 нм. Его величина составляет 0.5 %.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2002 - Томск - НИИ Онкологии

2001 - Прокопьев В.Е. Удут В.В. Борозновская Н.Н. Рентгенолюминесцентная диагностика состояния цельной крови. Межд. науч. практич. конф. «Медицинские и экологические аспекты ионизирующей радиации»: Тез. докл. Томск. 2001. с.125-126.

2002 - Удут В.В. Прокопьев В.Е. Микроспектральный анализ в изучении состояния периферической крови. Новые технологии в медицине. 2-я Объединенная научная сессия СО РАН и СО РАМН. Новосибирск. 2002. с.45.

2004 - Прокопьев Владимир Егорович. Биофизические механизмы воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на биологические ткани и оптические методы диагностики их состояния. Диссертация доктора физико-математических наук. Томск. 2004.+

Регистрация спектров флуоресценции сывортки крови использовали спектрофлуориметр Hitachi-MPF-4 в диапазоне 400-800 нм. Диапазон возбуждения 350-400 нм. Спектры возбужденя регистрировались в диапазоне 250-600 нм.

1-спектр флуоресценции сыворотки.

Рис. 2-20. Спектры флуоресценции компонент крови. 1-плазма 2-сыворотка, 3- сильноразведенная цельная кровь. Широкополосное возбуждение 300-400 нм.

Спектры имеют полосы 410-430 нм и 550-580 нм, которые соответствуют металлопорфиринам.

Спектры сыворотки крови. Полоса 460-470 нм соответствует НАДН. Полоса 520-530 нм соответствует флавинам. Полоса 520-530 нм соответствует фолиевым кислотам. В спектре сыворотки крови в норме не были обнаружены порфирины. Отношение I530/I470 в норме равно1,6. При заболеваниях изменяется.

99

В спектре плазмы крови дополнительно наблюдались полосы порфиринов – 580, 610, 618, 630, 640, 660. Измерения спектров поглощения и спектров возбуждения флуоресценции позволило отнести эти максимумы к полосам флуоресценции копропорфирина ( гематопорфирина и протопорфирина).

При язвенной болезни желудка в 90% случаев появляся пик 625 нм. Спектр возбуждения флуоресценции на длине волны 635 нм содержит пики 405, 500, 540 и 580 нм. Полоса 625 нм совпадает с полосой поглощения протопорфирина IX.

2-Разность спектров флуоресценции сыворотки крови и плазмы крови.

Рис. 2-21. Спектр флуоресценции сыворотки и плазмы крови, и разность двух спектров. Расхождение в диапазоне 700 нм связано с наличием в плазме свободного гемоглобина, который возникал во время центрифугирования при разрушении эритроцитов.

Отличия в спектрах этих компонент возникают вблизи 420нм и при длинах волн более 600нм. Первое отличие связано с разной концентрацией гемоглобина в этих компонентах, второе - с присутствием порфиринов.

3-флуоресценция ионов железа – 715 нм.

Рис.2-22. Спектр флуоресценции мазка цельной крови онкологического больного, возбуждение 395 нм. Пики 690, 715, 730 и 760 нм связаны с излучением молекул, в которых содержится трехкратный ион железа.

Если в гемоглобине окислить ион железа (II) до степени окисления +3, то способность связывать кислород исчезает. Соединение иона железа с кислородом делает кровь красной (поглощение гемоглобином излучения в зеленой области спектра).

100