6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой

2.1.4 Зарубежная литература по автофлюоресценции клеток крови.

2001 - Patrick Bondza-Kibangou, Christine Millot, Jean Dufer, Jean-Marc Millot (Franse) Microspectrofluorometry of autofluorescence emission from human leukemic living cells under oxidative stress. Biology of the Cell 93 (2001) 273−280.

2004 - Shumei Gao, Xiufeng Lan, Ying Liu, Zhonghua Shen, Jian Lu, and Xiaowu Ni, (China)

"Characteristics of blood fluorescence spectra using low-level, 457.9-nm excitation from Ar+ laser," Chin. Opt. Lett. 2, 160-161 (2004). Исследуются спектры флуоресценции цельной крови, эритроцитов и гемоглобина при возбуждении 458 нм. Спектры флуоресценции крови а эритроцитов аналогичны.

2005 - Al-Daghri. A, Spectral characterization of cancer patients' blood. Thesis of Master of Science in Physics, 2005.

2006 – Buhong Li; Zhenxi Zhang; Shusen Xie; Rong Ch en. Three-dimensional fluorescence spectra of human blood. Proc. SPIE 6026, ICO20: Biomedical Optics, 60261F (January 11, 2006);

doi:10.1117/12.667656.

Исследуется двумерный спектр флуоресценции крови для выявления эндогенных флуорофоров. Выявлены пики поглощения 274, 345, 415, 541 и 576 нм. Пики флуоресценции

(260,630) - эндогенные порфирины, (280,340) – триптофан, (340,460) – NADH и NADPH, (450,520) - FAD.

2013 - Ji RD, Zhao ZM, Zhang L, Ji L, Zhang JH, Shen LB, Lan XF. Study on experiment of fluorescence spectra detection of pesticide residue of imidacloprid in apple juices. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2013 Mar.33(3): 668-71.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2002 – China – Huanzhomg University

2002 - Gao, S. Luo, X. Lan, X. Liu, Y. Lu, J. & Ni, X. (2002). Analyzing of LED-induced blood fluorescent spectra. Chinese journal of lasers, 11(2), 315-318.

2003 - Peng, C. Gao, S. Liu, Y. Lan, X. Shen, Z. Lu, J. & Ni, X. (2003). Investigation of LED-induced fluorescent spectra from human blood solution. Applied laser, 23(4), 232-235.

2013 – Changde Peng, Jinsong Liu. (China) Studies o n Red-Shift Rules in Fluorescence Spectra of Human Blood Induced by LED. Applied Physics Research; Vol. 5, No. 1; 2013.+

Рис. 2-29. Спектр поглощения (1) и флуоресценции (2) цельной крови прb возбуждении 407 нм.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1999 - Masilamani V. - King Saud University - Saud Arabia

111

Vadivel Masilamani. Mohamad Saleh AlSalhi. Trinka Vijmasi. Kanaganaj Govindarajan. Ram Rathan Rai. Muhammad Atif. Saradh Prasad. Abdullah S. Aldwayyan.

1999 - Karthikeyan K, Masilamani V. and Govindasamy S. Spectrofluorimetric detection of DMBAinduced mouse skin carcinoma. Pathol. Oncol. Res. 1999. 5. 46-48.

2003 - Masilamani V, Sivakumar N, and Vijay Anand K. Diagnosis of cancer from blood by native fluorescence. Asian JI Phy. 2003.12, 125-132.

2004 - V. Masilamani, K. Al-Zhrani, M. Al-Salhi, A. Al-Diab and M. Al-Ageily, Cancer Diagnosis by Autofluorescence of Blood Components. Journal of Luminescence, vol. 109, (3-4), p. 143-154, 2004. 2004 - Masilamani V, Al-Zhrani K, Al-Salhi M, Al-Diab A and Al-Ageily M. Cancer diagnosis by autofluorescence of blood components. Journal of Luminescence. (2004), vol. 109, (3-4). p.143-154.

Рис. 2-30. Спектр флуоресценции клеток крови в норме. Возбуждение 400 нм. Пики 590 и 630 нм – порфирины.

2005 - Masilamani V, Kalaivani R, Al-Daghri O, Raja H, Sivanandam SE, Al-Salhi M. Optical diagnosis of cancer from blood components, Egyptian Journal of Biophysics. 2005.12,1,p15-30.

2006 -Montana Ahmad Al-Thunayan. Cancer Diagnosis by synchronous fluorescence spectra of blood and urine components. 2006.

2006 - Masilamani, V. Kalaivani, R. Al-Daghri, O. et al. (2006). Optical diagnosis of cancer from blood components. Egypt. J. Biophysics. 12, 15–30.

2007 - Abdul R. Al Diab, V. Masilamani, M. Al Salhi, et al, ''Detection of Cancer of Pancreas by Native Fluorescence of Blood Component - A Preliminary Report '', Emirate Medical Journal 15 (1) : 29-38,2007

2008 - Kalaivani, R. Masilamani, V. Sivaji, K. Elangovan, M. Selvaraj, V. Balamurugan, S. G. AlSalhi, M. S. Fluorescence spectra of blood components for breast cancer diagnosis. Photomed Laser Surg 26, 251-256 (2008).+

2011 - Mohamad Saleh AlSalhi. Abdulaziz Mayuof Al Mehmadi. Aiman Abdoo. Vadivel Masilamani. Liver cancer diagnosis by fluorescence spectra of blood and urine. Proc. SPIE 8329, Tenth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine (PIBM 2011), 83290X (March 13, 2012). doi:10.1117/12.923788.

2011 – Alsalhi M, Masilamani V, Trinka V, Elangovan M, Kochupillai V, Shah N. Detection of cancer by optical analysis of body fluids-a single blind study. Technol Cancer Res Treat. 2011 Apr; 10(2):145-52.

112

2011 – Al-Salhi M, Masilamani V, Vijmasi T, Al-Nach awati H, VijayaRaghavan AP. Lung cancer detection by native fluorescence spectra of body fluids--a preliminary study. J Fluoresc. 2011 Mar; 21(2):637-45.

2011 - V. Masilamani. T. Vijmasi. M. AlSalhi. K. Govindarajan. A. p.Vijaya Raghavan. Ram Rathan Rai. Detection of cervical cancer by fluorescence emission and stokes' shift spectra of blood and urine.

Proc. SPIE 7895, Optical Biopsy IX, 78950A (February 16, 2011). doi:10.1117/12.874010.

Для диагностики онкологических заболеваний (цервикс) исследуется спектр синхронной флуоресценции крови и мочи со сдвигом длин волн 70 нм. Регистрация спектров флуоресценции проводилась с помощью спектрофотометра Shimadzu RF-5301PC в диапазоне

220-750 нм.

-Для спектра флуоресценции клеток крови вычисляется коэффициент I630/I580 - отношение флуоресценции нейтрального порфирина/основного порфирина. Это отношение равно 1 в норме и равно 3 при раке.

-Для спектра флуоресценции пламы крови вычисляется отношение I305/I340 – триптофан/коллаген – равно 1.9 в норме и 1.1 на ранней стадии рака и 0.9 для поздней стадии рака.

-Для спектра флуоресценции пламы мочи вычисляется отношение I450/ I360 – флавин/NADH – равно 0.2 в норме, и равно 0.8 для рака.

2012 – Masilamani V, Alsalhi MS, Vijmasi T, Govinda rajan K, Rathan Rai R, Atif M, Prasad S, Aldwayyan AS. Fluorescence spectra of blood and urine for cervical cancer detection. J Biomed Opt. 2012 Sep;17(9):98001-1.

Рис. 2-31. Спектр автофлюоресценции крови в норме.

Рис. 2-32. Спектр флуоресценции клеток крови в норме и при раке. Возбуждение 400 нм.

113

2007 - Ge X-H, Zhao Y-L, Zhang F-Q, Zhang L, Yao S-X, Qin Y (2007). Effect of cancer cells on the spectra of serums, spectroscopy and spectral analysis, 24(7): 841-843/

2008 - Wang LX, Zhao ZM, Xin YJ, Guo LF, Chen H. Experimental investigation of fluorescence spectra of serum excitated with different wavelength light. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2008 Oct.28(10):2360-2364.

2008 - Zhao Z-M, Xin Y-J, Wang L-X, Zhu W-H, Zheng M, Guo X (2008). Measurement and analysis of absorption spectrum of human blood, spectroscopy and spectral analysis, 28(1): 726-728.

2008 - Zhu W-H, Zhao Z-M, Guo X, Wang L-X, Chen H (2008). Study of glucose concentration based on serum UV absorption spectra, J. Life Sci. USA, 2: 62-66.

2008 - Zhu W-H, Zhao Z-M, Guo X, Wang L-X, Chen Hui (2008). Investigation of cholesterol concentration based on serum fluorescence spectra, optics in health care and biomedical optics III, Proc. of SPIE, Vol. 6826, 68262U1-U5/

2008 - Zhao Z-M, Chen Y-M, Yu X-L, Xin Y-J (2003). Characteristic analysis and application of blood fluorescence spectra, spectroscopy and spectral analysis, 23(5): 922.

2009 - Zhu WH, Zhao ZM, Guo X, Chen H. Study of cholesterol concentration based on serum UVvisible absorption spectrum. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2009 Apr.29(4):1004-7.

2009 - Wang LX, Zhao ZM, Chen H, Li P, Xin YJ. Effect of the change in serum concentration on serum fluorescence spectrum. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2009 May.29(5):1336-40.

2010 - Zhu Weihua, Zhao Zhimin, Guo Xin and Hong Xiaoqin. Study on serum fluorescence spectra based on wavelet transform. African Journal of Biotechnology Vol. 9(6), pp. 892-899, 8 February,

2010.+

В спектре флуоресценции сыворотки крови выявлены следующие пики - 287, 313, 344, 370 и 404 нм, при возбуждении 230 нм.

Рис. 2-34. Спектр флуоресценции сыворотки крови. Исследовано увеличение флуоресценции при увеличении концентрации липидов.

115

2.1.5 Регистрация автофлуоресценции клеток с помощью проточной цитофлуорометрия. (Flow Cytofluorometry).

Обычно клетки крови окрашивают флуорохромом и анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа. Однако этот метод позволяет проанализировать очень малое количество клеток. Одним из новых и мощных методов исследования клеток крови является метод проточной цитофлуориметрии. Клетки пропускаются по одной через капилляр. На клетку, проходящую через зону измерения, воздействует луч лазера с определенной длиной волны, и детекртор регистрирует излучение на определенной длине волны. Проточных цитофлуоримето позволяет за несколько минут проанализировать тысячи клеток. Возможен анализ окрашенных клеток. Обычно проточные цитофлуориметры используются для иммунофлуоресцентного анализа, подсчета количество клеток, на которые сели флуоресцентные метки. Длины волн возбуждающих лазеров выбираются в соответствии с используемыми метками. Однако возможно использование проточного цитофлуориметра лля анализа автофлуоресценции клеток.

С момента выпуска первого коммерческого проточного цитофлюориметра ICP11 в 1968 году и по настоящее время, компания Partec GmbH (Германия) является признанным лидером в проточной цитофлюорометрии.

Рис. 2-35. Схема проточного цитофлуориметра.

Рис. 2-36. Схема проточного цитофлуориметра. 1-датчик флуоресценции, 2-датчик флуоресценции, 3-суспензия клеток, 4-проточнкая камера, 5-датчик рассеяния, 6-блок обработки сигналов, 7-отклоняющие пластины, 8-сбор клеток, 9-лазер.

116

1991 - Богатырев Владимир Николаевич. (Москва, ОНЦ) Значение количественных методов исследования (морфометрии, проточной цитофлуорометрии, сканирующей микрофотометрии в клинической онкоцитологии). Диссертация доктора медицинских наук. Москва. 1991. 426с.

2002 - Stoya G1, Klemm A, Baumann E, Vogelsang H, Ott U, Linss W, Stein G. Determination of

autofluorescence of red blood cells (RbCs) in uremic patients as a marker of oxidative damage. Clin Nephrol. 2002 Sep;58(3):198-204. В работе методом проточной цитофлуориметрири анализируется автофлюоресценция эритроцитов. Исследуется изменение автофлюоресценции эритроцитов при уремии.

------------------------------------------------------------------------------------------------------

2005 - Jiménez-Díaz MB1, Rullas J, Mulet T, Fernández L, Bravo C, Gargallo-Viola D, AnguloBarturen I. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 2005 Sep;67(1):27-36.

Рис. 2-37. Флуоресценция эритроцитов. По первому каналу - автофлюоресценция, по второму каналу - флуоресцентная метка YOYO-1. Две выделенные области - нормальные и зараженные

Plasmodium falciparum эритроциты.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2010 - Москва - НИИ кардиологии 2010 - Габбасов Зуфар Ахнафович. Тромбоциты и ядросодержащие клетки крови в развитии

стенозирующих поражений артерий. Диссертация доктора биологических наук. Москва. 2010. 2013 - Имаева Асия Эмверовна. (Москва, НИИ Кардиологии) Изучение роли циркулирующих остеонектин-положительных клеток и эозинофильных гранулоцитов в возникновении рестеноза у пациентов, подвергшихся коронарному стентированию с помощью стентов с лекарственным покрытием. Диссертация кандидата медицинских наук. Москва. 2013.

В пробе крови с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur по параметрам светорассеяния клеток определяли процентное содержание CD45+ гранулоцитов с высоким уровнем автофлуоресценции (автофлуоресценция+/CD45+).

При проведении методом проточной цитофлуориметрии детального анализа состава клеточных субпопуляций лимфоцитоподобных клеток (CD45-положительные лейкоциты) крови больных ИБС в некоторых экспериментах были выявлены клетки, обладающие интенсивной автофлуоресценцией по каналу FL-1. В крови пациентов с рестенозом было обнаружено большее, чем в крови больных без рестеноза, количество клеток с интенсивной автофруоресценцией. Анализ данных литературы показал, что подобная автофлуоресценция характерна для эозинофильных гранулоцитов и связана с интенсивным свечением специфических цитоплазматических гранул эозинофилов, даже в том случае, когда клетки не окрашены флуоресцентными зондами [Weil G.J. Chused T.M. 1981, Thurau A.M. et. al. 1996].

117

Предположение о том, что обнаруженная популяция клеток с интенсивной автофлуоресценцией является эозинофильными гранулоцитами, было подтверждено специалистами из ФГБУ «Гематологический Научный Центр МЗ РФ».

Было выявлено, что количество эозинофильных гранулоцитов с высоким уровнем автофлуоресценции в крови пациентов, у которых после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом, развился рестеноз, значительно выше, чем в крови пациентов без рестеноза.

Рис. 2-38. Гистограммы зависимости интенсивности флуоресценции лейкоцитов, меченных антителами к CD45, по каналу FL-3 (СD45-PC5) от интенсивности автофлуоресценции лейкоцитов по каналу FL-1. Область R2 - лейкоциты с интенсивной автофлуоресценцией.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------

118

При анализе фитопланктона в морской воде возможно использование проточного цитофлуориметра для регистрации автофлюоресценции с целью выяснение чиленности и струткуры популяции.

Рис. 2-39. Распределение частиц - picoplancton.

1997 – Новосибирск – Институт Химической Кинетики и Горения Лаборатория Цитометрии и Биокинетики Мальцев Валерий Павлович – зав лаб, дффмн, проф.

http://cyto.kinetics.nsc.ru/index_rus.html - сайт лаборатории

1997 - Valeri Maltsev; Andrei Chernyshev. Method and device for parameters of individual

microparticles. United States Patent 5,650,847 Jul 22, 1997/

Разработан проточный цитофлуориметр «BioUniScan» для регистрации размеров, рассеяния и флуоресценции частиц. Биофизические свойства основных клеток крови изучаются с использованием сканирующей проточной цитометрии, с помощью которой сигналы светорассеяния и флуоресценции регистрируются с одиночных клеток, движущихся в потоке.

119

2.2 Экзогенные флуорофоры в крови-индуцированная флуоресценция крови.

Для исследования различных процессов, происходящих в организме, часто используют метод введения в кровь различных флуорофоров. Одним из основных используемых флуорофоров является флуоресцеин. Метод используют для различных целей:

А- Флуоресцеиновая проба - исследование скорости кровообращения, Б - Определение объема циркулирующей крови, В - Определение скорости всасывания в желудочно-кишечном тракте,

Г - В офтальмологии для изучения нарушений кровеносных сосудов в сетчатке глаза, Д - При операциях гортани применяется внутривенное введение раствора риванола для

усиления контраста в цвете люминесценции между злокачественной опухолью и здоровой тканью, Е - Определение эффективности механизма выведения флуорофора печенью, изучение

физиологии печени.

А- Флуоресцеиновая проба - исследование скорости кровообращения.

Метод определения скорости кровотока разработан Кохом, Вольгеймом и Ланге, а также Фишбахом. Проходимый путь: локтевая вена → правое сердце → легочные капилляры → левое сердце → артерии → капилляры губ (или, соответственно, пальцев рук и ног). Измеряется время между окончанием инъекции и оптическим восприятием свечения или зеленожелтоватого окрашивания губ (рук, ног). С этой целью применяют ультрафиолетовую или же кварцевую лампу, снабженную соответствующим светофильтром. В норме оптический эффект флуоресцеина становится заметным на губах через 12-16 секунд (на кисти через 18-28, а на стопе через 26-60 секунд). Выраженное запаздывание появления свечения или полное отсутствие флуоресценции на дистальных частях тела указывает на тяжелые органические или функциональные изменения сосудов.

1941 - Fishback D.J. J. Lab. Clin. Med. 1941. 26. p.1966. Исследовали скорость кровообращения с помощью внутривенного введения флуоресцеина.

1943 - Флуоресцеиновая проба (Dingwall и Lord, 1943. Myers,1962).

- DeMent J. Fluorobiology. Bull. No.6. Ultra Violet Products Inc. San. Gabriel California. При ведении в локтевую вену 10-15% раствора флуоресцеина, то краситель быстро распространчется по всему телу. Через несколько секунд ярко-зеленую флуоресценцию можно наблюдать в тканях глаза, слизистой рта и на губах.

1944 - Peacock P.R. Nature. 153. 136. (1944). Флуоресценция в посмощь физиологии.

Исследовалась скорость кровотока. В ухо кролика впрыскивалась коллоидная суспензия бензопирена или антрацена. Из другого уха по каплям наблюдали вытекающую кровь. С помощью люминесцентного метода показано, что циркуляция окрови осуществляется гораздо быстрее, чем при исследовании с помощью впрыскивания других красок.

1950 - Potter J.M. McDonald D.A. Nature 166. 596. (1950). Кинематографическая запись быстроты тока артериальной крови (на кроликах).

------------------------------------------------------------------------------------------------------

Б - Определение объема циркулирующей крови.

2005 - Москва - МГМСУ

2005 - Кочанов Д.А. Полсачев В.И. Словоходов Е.К. Изучение микроциркуляции кишки люминесцентным методом. Актуальные вопросы клинической медицины. Москва, 2005. с.120-

121.

2006 - Кочанов Д.А. Полсачев В.И. Уртаев С.А. Словоходов Е.К. Флюоресцентный метод измерения объема циркулирующей крови. Клиническая медицина Центросоюза. Москва, 2006.

с.175-177.

120