6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой

подслаивается. Определяется флуоресценция не всего столба жидкости, а только пограничного слоя двух жидкостей. Исследование производится не в рессеянном ультрафиолетовом излучении, а в узком горизонтальном пучке. Это позволяет повысить чувствительность метода. Количественный анализ основан не на фотометрировании, а на определении предельного разведения, при котором регистрируется флуоресценция.

К - Хинидин.

1950 - Edgar A.L. Sokolow M. Опыты по количественному флуоресцентному анализу определения хинидина в крови. J. Lab. Clin. Med. 36. 478. (1959). Ch.A. 45. 701 (1951).

Л - Меланин (300,550) - максимумы поглощения и флуоресценции находятся при 300 и 550 нм соответственно. С помощью исследования флуоресценции меланина диагностируется рак кожи - меланома.

2007 -Steven Jacques. "Optical Absorption of Melanin: Extinction Coefficient of Melanin," Oregon Medical Laser Center, 2007.

2012 - Коблова Е.В. Каменских Т.Г. Башкатов А.Н. Тучин В.В. Генина Е.А. (Саратов, СГУ) Определение содержания меланина в радужной оболочке глаза человека в норме и при первичной открытоугольной глаукоме. 2012.+ Для регистрации спектров отражения использовалась установка ЛЭСА-5. Спектры пропускания анализировались с помощью установки ЛЭСА-6м.

Л1 – фибрин (280,344)

При изменении рН раствора от 4.2 до 7.4 происходит красный сдвиг максимума флуоресценции с 344 до 354 нм.

М - Коллаген I и II (377,397) - максимумы поглощения и флуоресценции находятся при 377 и 397 нм соответственно. Коллаген имеет белковую флуоресценцию (280, 305) и флуоресценцию (340, 405). С Увеличением возраста интенсивность белковой (тирозиновой) флуоресценции 305 нм падает, а интенсивность флуоресценции 405 нм возрастает. Так же имеется пик (410, 490).

Коллаген - структурный белок соединительной ткани и самый распространенный протеин у млекопитающих. Максимум его спектра поглощения лежит в районе 340 нм, а эмиссии - 380 нм. Установлены следующие сочетания максимумов возбуждения и люминесценции коллагена: (280,310), (265,385), (330,390), (450,530) нм.

2003 - Anderson, C.M.; Wold, J.P. Fluorescence of muscle and connective tissue from cod and salmon. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, p.470–476. Для коллагена тип I и тип V получены следующие значения возбуждения-флуоресценции – (337,430), (337,480).

1992 - Odetti PR. Borgoglio A. Rolandi R. Age-related increase of collagen fluorescence in human subcutaneous tissue. Metabolism. 1992. № 41. p.655-658.

1995 - Stryer L, "Biochemistry", 4th ed, W.H. Freeman and company, New York USA, 1995.

71

О - Кератин (Keratin).

Рис. 1-79. Двумерный спектр флуоресценции кератина (Keratin).

1996 - Davis R. Savage H. Sacks P. Alfano R. Schantz S. The influence of keratin on native cellular fluorescence of human skin. Pros. SPIE. 1996. Vol. 2679. p.216-226.

О1 – Креатин (creatine).

1967 - Dawson, D. M. Eppenberger, H. M. and Kaplan, N. 0. The comparative enzymology of creatine kinases. J. Biol. Chem. 242,210 (1967).

1973 - Elevitch, F. R. and Brownlow, K. A new fluorometric determination of serum creatine phosphokinase isoenzymes: Detection of CPK2 in myocardial infarction and fatal cardiovascular disorders. J. Clin. Pathol. 59, 133 (1973).

1977 - Weseley, S. A. Byrnes, A. Alter, S. et al. Presence of creatine phosphokinase brain band in the serum of chronic renal disease patients. Clin. Nephrol. 8, 345 (1977).

1978 - Aleyassine H, Tonks DB, Kaye M. (Canada) Natural fluorescence in serum of patients with chronic renal failure not to be confused with creatine kinase-BB isoenzyme. Clinical Chemistry. 24, 492-494 (1978).+

1978 - Aleyassine H, Tonks DB. Albumin-bound fluorescence: A potential source of error in fluorometric assay of creatine kinase BB isoenzyme. Clinical Chemistry. 24, 1849-1850 (1978). Letter.+

74

1978 - Collen RB, Herbstman R, Hermann 0. Spurious brain creatine kinase in serum from patients with renal disease. Clinical Chemistry. 24, 1636-1638 (1978).+

1981 - Digenis G, Hadjivassiliou AG,Mayopoulou-Symvoulidis D, et The unidentified fluorescent substance(s) in serum of patients with chronic renal failure: Correlation with serum creatinine. Clinical Chemistry. 27, 1618-1619 (1981).+

П - Каротин.

1972 - Карнаухов В.Н. Татарюнас т.Б. Петруняка В.В. Накопление каротиноидов в мозге и сердце животных при старении. Роль каротиноидов в формировании липофусцина. Биофизика живой клетки. т.3. Пущино. 1972. с.64-75.

1973 - Карнаухов В.H. Функции каротиноидов в клетках животных. М. “ Наука”, 1973.

1999 - Xiaozhou Li. Qiuyu Wang. Junxiu Lin (China) Laser-induced blood serum fluorescence and

Raman spectroscopy for cancer diagnosis. Proc. SPIE 3863, 1999 International Conference on Biomedical Optics, 301 (September 17, 1999). doi:10.1117/12.364402. Анализируется спектр флуоресценции здоровых людей и пациентов с раком. Концентрация бета-каротина в крови у здоровых людей намного больше, чем у больных раком.

Р - Липофусцин.

Липофусцин (lipofuscine) - гликопротеид, содержащийся в цитоплазме клеток всех органов и тканей в виде мелких желто-бурых глыбок вокруг ядра. Содержание липофусцина увеличивается при старении организма. Максимум флуоресценции липофусцина - 440 нм.

Флуоресценция липофусцина обнаружена на длинах волн 560, 570 и 608 нм (желтая область спектра). В спектрах флуоресценции кожи женщин старших возрастных групп, кроме полос излучения восстановленных пиридиннуклеотидов (490 нм - голубая область спектра) и окисленных флавопротеидов (520 нм - зеленая область спектра) появляется более выраженная, чем у молодых женщин дополнительная желтая полоса излучения с максимумом 560-565 нм. Возможно, что эта полоса, соответствующая флуоресценции липофусцина, обязана своим происхождением каротиноидам, входящим в состав этих липофусциновых гранул. Стоит отметить, что спектры флуоресценции отдельных гранул липофусцина состоят из полос флуоресценции отдельных соединений. Вариации относительных интенсивностей этих полос определяют форму результирующего спектра флуоресценции. Не исключено, что среди флуорофоров, входящих в состав липофусциновых гранул, помимо каротиноидов есть и окисленные ненасыщенные жирные кислоты.

Липофусцин - вещества, получающиеся в результате переокисления (окисление в перекисное соединение) липидов.

75

2012 - Арбуханова П.М. Яковлева М.А. Фельдман Т.Б. Борзенок С.А. Островский М.А. (Москва, МНТК микрохирургии глаза) Спектры флуоресценции и состав флуорофоров липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека в норме и в случае визуализируемой патологии. Офтальмохирургия. 2012. №3.+

С - Нуклеиновые кислоты - ДНК, РНК.

ДНК. Гуанин - азотистое основание ДНК, содержится в клетках.

1959 - Барский И.Я. Об ультрафиолетовой флуоресценции гуанина на бумажной хроматограмме и в растворе. Биохимия. 1959. т.24. №5. с.823.

1996 - Millar, David P Fluorescence studies of DNA and RNA structure and dynamics. Current Opinion in Structural Biology 6 (1996) с.322-326. DOI:10.1016/S0959-440X(96)80050-9.

Т - Продукты окислительно-восстановительных реакций.

Важную роль в процессах возникновения и развития опухоли играет свободно-радикальное окисление.

2008 - Меньщикова Е.Б. Зенков Н.К. Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск. 2008. 284 с.

Гранулоциты и моноциты крови и тканевые макрофаги для борьбы с чужеродными клетками выделяют, так называемые, активные формы кислорода (супероксидный радикал - пероксид водорода и радикал гидроксила).

У- ионы железа.

Рис. 1-82. Спектры поглощения ионов железа с различной валентности. 1-спектр возбуждения флуоресценции железа I, 2-спектр возбуждения флуоресценции железа II, 3-спектр поглощения железа III.

77

1.5 Метод ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография с детектором флуоресценции.

Хроматограические системы, в которых используются спектрофлуориметрические детекторы, обладают высокой селективностью и чувствительностью. Свойством аутофлуоресценции обладают катехины и индолы.

Катехоламины – возбуждение 200-220 и 280-380, флуоресценция 310-330. Индолы – возбуждение 210-220, флуоресценция 360 нм.

1979 - Krustulovic F.M. Powell A.M. J. Chromatogr.1979. 171, 345. – Обнаружение индола.

1980 – Longas M.O Poh-Fitzpatrick M.B. Anal. Bioche m. 1980. 104. 268. Определение порфиринов в крови.

1983 – Hlsao Mabuchl and Hisamitsu Nakahashl (Japan ) Liquid-Chromatographic Profiling of

Endogenous Fluorescent Substances in Sera and Urine of Uremic and Normal Subjects. Clinical Chemistry. Vol. 29, No. 4, 1983. p.675-677.+ С помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором исследовали сыворотку крови и мочу. Возбуждение 322, флуоресценция 415 нм. Обследовались здоровые пациенты и пациенты с уремией. Выявлено различие.

2006 - Siddappa M. Chidananda, Kapaettu Satyamoorthy, Lavanya Rai, Attibele P. Manjunath and Vasudevan B. Kartha. (India, Karnataka) Optical diagnosis of cervical cancer by fluorescence

spectroscopy technique. International Journal of Cancer. 1 July 2006. Volume 119, Issue 1, pages 139– 145,+ Гомогенат ткани исследовался с помощью метода HPLC – high performance liquid chromatography laser indused fluorescence – ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография с регистраций флуоресценции индуцированной лазером.

2012 - Арбуханова П.М. Яковлева М.А. Фельдман Т.Б. Борзенок С.А. Островский М.А. (Москва, МНТК микрохирургии глаза) Спектры флуоресценции и состав флуорофоров липофусциновых гранул ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека в норме и в случае визуализируемой патологии. Офтальмохирургия. 2012. №3.+

78

Глава 2. Флуоресценция крови.

При флуоресцентном методе исследования крови необходимо выделить несколько направления:

-флуоресценция цельной крови, -флуоресценция сыворотки крови, -флуоресценция эритроцитов, -флуоресценция мембран эритроцитов, -флуоресценция лейкоцитов.

В зависимости от того, используются флуоресцентные красители или нет имеется два варианта:

-автофлуоресценция (сыворотки и клеточных элементов)

-флуоресценци с добавлением красителя (к сыворотке или к клеточным элементам).

Наиболее информативным и целесообразным является параллельная регистрация флуоресценции цельной крови (эритроцитов) и сыворотки крови.

Флуоресценцию крови можно регистрировать при использовании различных методов пробоподготовки:

1-в жидком виде:

-исследование флуоресценции крови в кювете, -исследование флуоресценции крови, нанесенной на фильтровальную бумагу. 2-в высушенном виде:

-исследование флуоресценции порошка высушенной крови, -исследование флуоресценции тонкой пленки (мазка) высушенной крови.

Аутофлуоресцентные методы. Флуоресценция жидкостей.

1.Флуоресцентная спектроскопия биожидкостей с помощью стандартных спектрофлуориметров.

2.Метод ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография с детектором флуоресценции.

Флуоресценция клеток.

1.Флуоресцентная спектроскопия биожидкостей с помощью стандартных спектрофлуориметров.

2.Проточная цитофлуоремитрия в режиме автофлюоресценции.

3.Микроспектрофлуориметрия. Регистрация флуоресценции клеток с помощью флуоресцентного микроскопа.

2.1 Эндогенные флуорофоры в крови - автофлюоресценция крови.

Флуоресценция эндогенных флуорофоров в крови иначе называется собственной флуоресценцией крови, или автофлюоресценцией.

2.1.1 Автофлюоресценция сыворотки крови.

При анализе автофлюоресценции сыворотки крови можно выделить несколько разных подходов.

1- 350 нм – триптофан – белки. Два пика (274,348) и (231,350).

2- 415 нм – битирозин – продукт окисления белков. Пик (325,416).

3- 460 нм - коферменты НАД-Н. Пик (290,440)– восстановленный (bound), (350,460)-

окисленный (free).

79

2.1.1.1Анализ флуоресценции белков - пик триптофановой флуоресценции 350 нм.

2.1.1.2Анализ флуоресценции продуктов окисления белков, определение флуоресценции битирозина (bytyrosine, dytirosine), пик 416 нм.

2.1.1.3Анализ флуоресценции коферментов НАД Н.

Пик (290,440)– восстановленный, (350,460)-окисленный.

2.1.1.4Флуоресценция флавинов – 510 нм.

2.1.1.5Флуоресценция эндогенных порфиринов в крови.

2.1.1.6Диагностика туберкулеза по флуоресценции плазмы крови – пик (633,665).

2.1.1.7Флуоресценция иммуноглобулинов – 700 нм.

2.1.1.8Различные методы исследования флуоресценции сыворотки крови.

2.1.1.9Спектрофотометрия высушенной сыворотки крови.

2.1.1.10Исследование спектров возбуждения сыворотки крови.

2.1.1.1 Анализ флуоресценции белков.

Два пика триптофановой флуоресценции (274,348) и (231,350).

При анализе флуоресценции белков анализируют два основных параметра: интенсивность флуоресценции и положение максимума флуоресценции.

Рис. 2-1. Двумерный спектр флуоресценции альбумина, пик 1-(274,348), пик 2-(231,350).

80