6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой

2007 - Кочанов Д.А. Полсачев В.И. Уртаев С.А. Словоходов Е.К. Флюоресцентный метод измерения объема циркулирующей крови Актуальные вопросы маммологии, экспериментальной и клинической медицины. Москва. 2007. с.106-108.

2008 - Полсачев В.И. Кочанов Д.А. Флюоресцентная диагностика: история развития и состояние проблемы Хирург. 2008. № 4. с.28-32.

2008 - Кочанов Д.А. Полсачев В.И. Басанов Р.В. Намиот В.А. Определение объема циркулирующей крови с помощью спектрометрии плазмы Хирург. 2008. № 4. с.33-38.

2008 - Кочанов Д.А. Полсачев В.И. Намиот В.А. Флюоресцентная методика измерения объема циркулирующей крови. Врач-аспирант. 2008. № 2. с.154-159.

2008 - Кочанов Дмитрий Александрович (Москва, МГМСУ) Методика флюориметрии плазмы для измерения объема циркулирующей крови. Диссертация кандидата медицинских наук. Москва. 2008. 178с. Разработана флюоресцентная методика для измерения объема циркулирующей крови с помощью динатриевой соли флюоресцеина (флюрената).

Рис. 2-40. Динамика накопления и выведения флюрената в плазме при его однократном внутривенном введении. 1-практичкеская кривая, 2-теоретическая кривая.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

В - Определение скорости всасывания в желудочно-кишечном тракте.

1979 - Брумберг И.Е. Пятовская Н.Н. Ковальчук В.И. (Санкт-Петербург, НИИ скорой помощи) Исследование процесса всасывания в желудочно-кишечном тракте методом флуоресцентного анализа. Лабороторное делою 1079. с.264-266.+ организм вводится водный раствор уранина (натриевая соль флуоресцеина) методом per os (заглатывания). Опредляется концентрация флуорохрома в крови через определенные промежутки времени.

121

2.2.1 Флуорофоры для фотодинамической терапии в крови.

Анализ концентрации экзогенных флуорофоров в крови производится при исследовании фармакокинетики действия экзогенных флуорофоров на организм. Определяется оптимальный способ введения флуорофоров (прием внутрь, ингаляционно, внутривенно), и динамика изменения концентрации.

2006 - Филоненко Елена Вячеславовна (Москва, МНИОИ) Флуоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия в онкологии. Диссертация доктора медицинских наук. Москва. 2006. 235с. Исследовалась фармакокинетика препарата Аласенс. Фармакокинетика препарата оценивалась по накоплению Аласенс-индуцированного протопорфирина IX в крови и моче.

Рис. 2-41. Динамика изменения концентрации Аласенс-индуцированного протопорфирина IX в плазме крови после приема препарата Аласенс внутрь.

2.2.2 Флуоресценция лекарств в крови.

Флюоресцирующие соединения могут быть определены в очень низких концентрациях, часто в присутствии посторонних веществ. Поэтому регистрация флуоресценции успешно используется для количественного определения многих биологически важных веществ.

Хинин.

Одним из наиболее ярко флюоресцирующих лекарственных соединений является хинин. В кислых растворах он люминесцирует в синей области (450-475 нм). Чтобы определить его в плазме крови проводят осаждение белков метафосфорной кислотой и измеряют флуоресценцию хинина прямо в фильтрате. Впервые флуоресценцию соединений хинина наблюдал физик Джордж Стокс в 1852 году.

Яркой синей флюоресценцией обладает противогрибковый препарат гризеофульвин, он легко определяется в экстрактах из крови или мочи. Барбитураты в щелочной среде обладают яркой зеленой флюоресценцией, их можно определить в экстрактах из биологического материала.

После экстракции возможна количественная регистрация многих витаминов, например витамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-области при 330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А - зеленую флюоресценцию. Витамины С, D, В12 и др. удается определить по вторичной люминесценции.

Наркотические вещества морфин и героин флюоресцируют очень слабо, но после обработки образцов серной кислотой с последующим выщелачиванием возникает специфическая интенсивная синяя флюоресценция продуктов реакции. Этим методом удается определить до 0,02 мкг наркотика в пробе.

122

2.2.3 Окраска препаратов с помощью акридинового оранжевого.

Акридиновый оранжевый обладает свойством полихромазией - свойством неодинаково связываться с различными клеточными структурами. При этом изменяется длина волны флуоресценции. Его применяют для прижизненного выявления ядерного материала в форменных элементах крови, содержащего ДНК. Ядра (ДНК) флуоресцируют зеленым цветом, а РНК красным, микроядра, в которых изменилась структура ДНК, светятся темнокрасным цветом.

1952-Мейсель М.Н. Корчагин В.В. Люминесцентно-микроскопическое выявление нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Бюл. экспер. биол. мед. 1952, т.33, № 3, с.49.

1959 - Санкт-Петербург - ВМА

1959 - Закржевский Е.Б. Васильева Л.Г. О методах флуоресцентно-микроскопических исследований клеток крови. Лабораторное дело. 1959. с.8-10.+ Окраска клетокакридиновым оранжевым.

1959 - Закржевский Е.Б. Васильева Л.Г. О применении флуоресцентной микроскопии в гематологических исследованиях. Тр. 4-й Всес. Конф. 1959. с.87-94.

1961 - Закржевский Е.Б. Васильева Л.Г. Исследование ретикулоцитов методом флуоресцентной микроскопии. Врачебное дело. 1961. №9. с.42-45.

1962 - Закржевский Е.Б. О первичной флуоресценции эритроцитов. 1962. №9. с.126-128.

1963 - Закржевский Е.Б. Васильева Л.Г. Люминесцентная микроскопия в клиникогематологических исследованиях. Ленинград. Медицинская литература. 1963. 87 с.+

1959 - Барский И.Я. Папаян Г.В. Фаддеева M.Д. (Санкт-Петербург, ГОИ) Определение биспиральной ДНК в смеси с денатурированной по флуоресценции акридинового оранжевого в комплексе с ДНК. II. Двухволновый метод. Цитология. 1969. т.11. № 1. с.64-70.

1961 - Трусов В.В. Лаврентьев Э.В. (Ижевск, ИМИ) Микролюминесцентный анализ как метод выявления ранних изменений в периферической крови при применении радиоактивных изотопов. Лабораторное дело. 1961. №1. с.6-9.+

1961 - Свиридов Н.К. (Москва, ГНИИРРИ) Люминецентное выявление липидов в лейкоцитах крови при лучевой болезни. Лабораторное дело. 1961. с.15-16.+

1963 - Морозов Ю.В. Особенности люминесценции димеров акридинового оранжевого и родамина Б. Биофизика. 1963, т.8. № 3, с.331.

1963 - Лярская Т.Я. Москва, Институт вирусологии) Дифференцирование клеточных элементов в спинномозговой жидкости с помощью люминесцентной микроскопии. Лаборатоное дело.

1963. №3. с.137-138.+

1963 - Молотилова Г.П. (Москва, ЦИУВ) Данные люминесцентного исследования клеток крови и костного мозга здоровых людей. Лабораторное дело. 1963. с.259-263.+

1964 - Невская Е.А. (Москва, МНИОИ) Цитологическая диагностика ранних форм рака шейки матки при профилактических осмотрах с использованием люминесцентной микроскопии. Лабораторная диагностика. 1964. с.205-208.+

1964 - Фадеева М.Д. Спектральные свойства комплексов акридинового оранжевого с нативной, денатурированной и ренатурированной ДНК. Цитология. 1964. т.6. № 2. с.241-244.

1964 - Борисова О.Ф. Туммерман Л.А. Люминесценция комплексов акридинового оранжевого с

123

нуклеиновыми кислотами. Биофизика, 1964, т.9, № 5.

1965 - Борисова О.Ф. Туммерман Л.А. Применение люминесценции красителя акридинового оранжевого для изучения вторичной структуры нуклеиновых кислот. Биофизика, 1965, т.10,

№1, с.32-36.

1966 - Борисова О.Ф. Изучение люминесценции комплексов акридинового оранжевого с нуклеиновыми кислотами. Диссертация кандидата наук. M. 1966.

1965 - Шиллер-Волкова Н.Н. Соломатина т.П. (Москва, МНИОИ) Распознавание раковых клеток в мокроте люминесцентно-микроскопическим методом. Лаборатоное дело. 1965. с.197-

200.+

1965 - Каломкарова М.Б. Кофман Е.Б. Филатова Л.Г. Штранкфельд И.Г. О связывании акридинового оранжевого мышечными белками.- Цитология, 1965, т.7, № 2, 240-243.

1965 - Ковнатор Б.Я. Зельдович Д.Р. (Санкт-Петербург, ГОД) Оценка люминесцентноцитологического метода исследования для диагностики рака шейки матки. Лабораторное дело.

1965. с.200-204.+

1965 - Счастный Э.И. Ершов Ф.И. Ритова В.В. (Москва, Институт вирусологии) Способ люминесцентной микроскопии клеток культуры тканеи, выращенной непосредственно в пробирке. Лабораторное дело. 1965. №2. с.81-84.+

1965 - Ляпунова Е.А. Петрикевич С.Б. Зеленин А.В. О прижизненности люминесцентномикроскопических исследований, проводимых с помощью флуорохромов акридинового оранжевого и 3,4-бензпирена. Изв. АН СССР. Сер. биол. 1965, т.6, 980.

1966 - Рапопорт С.И. Голубева Л.А. (Москва, ММА) к применению люминесцентной микроскопии в желудочной патологии. Лабораторное дело. 1966. с.148-150. Окраска клеток проводилась акридиновым оранжевым.

1966 - Лопатченко О.И. Левинсон Л.Л. (Санкт-Петербург, ЛПМИ) Применение люминесцентной микроскопии для кольпоцитодиагностики срока родов. Лабораторное дело.

1966. с.79-81.+

1966 - Фридман И.А. Федоткина И.Д. (Санкт-Петербург, Рощинская больница №3) О диагностике трихомонадной инвазии по сухим мазкам методом люминесцентной микроскопии. Лабораторное дело. 1966. с.14-16.+

1968 - Полянский Ю.Н. Карнаухов В.Н. О взаимодействии акридинового оранжевого с глицеринизированным мышечным волокном. Биофизика. 1968. т.13. № 5. с.902-905.

1969 - Фаддеева M.Д. Определение биспиральной ДНК в смеси с денатурированной по флуоресценции акридинового оранжевого в комплексе с ДНК. I. Исследование интенсивности зеленой флуоресценции.- Цитология. 1969. т.11. № 1. с.56-63.

1971 - Зеленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой. М. Наука. 1971.

1975 - Кост Е.А.. Люминесцентная микроскопия в гематологии. Справочник по клиниколабораторным методам исследования. М.: Медицина, 1975. с.191 -231

1977 - Карнаухов В.Н. Колаев В.А. Яшин В.А. Франк Г.М. (Пущино, ИБФ) Спектральные характеристики флуорохромированных акридиновым оранжевым клеток белой крови человека.

Биофизика. 1977. т.22, №6. с.1015-1023.+

124

исследованиях функционального состояния и физико-химической характеристики органов, тканей, клеток.

Преимущества флуоресцирующих красителей перед обычными цитологическими или гистологическими реактивами заключается прежде всего в возможности применять флуорохромы в самых минимальных количествах и в очень слабых концентрациях (1:100000 - 1:5000000). Благодаря этому химическое, повреждающее воздействие на клетки сводится до минимума, объект изучается в наиболее физиологических условиях. Относительная безвредность флуорохромирования позволяет так же широко использовать метод прижизненной окраски, имеющий большие преимущества, особенно в цито- и гистофизиологии.

Достоинство метода флуорохромирования состоит в быстроте работы. Для проведения исследования обычно требуются доли минуты. Даже самая длительная окраска препаратов занимает максимум 20-30 минут. Расход флуоресцирующих красок из-за больших разведений очень невелик.

Выбор флуорохрома диктуется целью исследования, характером объекта, природой флуоресцирующего вещества, его кислотностью, цветом и др.

По физико-химическим свойствам флуоресцентные красители можно разделить на три группы.

1.Щёлочные флуорохромы - характеризуются тем, что находятся в кислой среде в сильно диссоциированном состоянии. Флуоресцирующим компонентом краски является положительно заряженный катион. В сильно щёлочных растворах такие краски находятся в недиссоциированном состоянии.

2.Кислые флуорохромы - диссоциируются в щёлочной среде. Флуоресцирующим компонентом краски является отрицательно заряженный анион.

Электронейтральные флуорохромы - слабо кислые или слабо щёлочные краски, диссоциация которых при флуорохромировании не имеет практического значения, поскольку флуоресцирующими свойствами обладает целая молекула.

Различные красители имеют различные длины волн флуоресценции: флуоресцеин - 525 нм, уранин - 530 нм, корифосфин - 525 нм, акридиновый оранжевый - 535 нм).

При исследовании липопротеинов сыворотки крови используются следующие флуоресцентные красители - родамин 6Ж и нильский синий.

1975 - Кост Е.А. Люминесцентная микроскопия в гематологии. Справочник по клиниколабораторным методам исследования. М. Медицина, 1975. с.191-231.

1980 - Владимиров Ю.А. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.Наука. 1980. 320 с.

1989 - Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов.

М. Наука. 1989. 277 с.

1995 - Шерстнев М.П. Азимбаев Т.К. Владимиров Ю.А. (Москва, НИИФХМ) Активированная нильским синим железоинициированная хемилюминесценция желточных липопротеидов.

Биофизика. 1995. т.40. №3. с.531-535.+

1963 - Ковнатор Б.Я. (Санкт-Петербург, ЛГОД) К методике выявления эритроцитов при люминесцентно-итологических исследованиях. Лабораторное дело. 1963. №5. с.263-265.+ Окраска эритроцитов проводилась с помощью карболового аурамина.

126

Исследование сыворотки крови.

С помощью флуоресцентных методов можно исследовать различные свойства сыворотки

крови.

2006 - Дюбко т.С. О некоторых аспектах применения флуоресцентного анализа в криобиологии. 1. Собственная флуоресценция белков. Вестник Харьковского национального университета.

Серия биология. 2006. т.3, №729. с.221-231.+

2006 - Дюбко т.С. и др. Влияние замораживания на плазму донорской крови. Вестник Харьковского национального университета. Сер. биология. 2006. т.4, №748. с.128-133.

2010 - Иванова С.В. Кирпиченок Л.Н. (Витебск, ИГМУ) Флуоресценция, протеолитическая и ингибиторная активность сыворотки крови при хранении и размораживании. Медикобиологические проблемы жизнедеятельности. 2010. №1(3) с.36-41.+

2008 - Розенталь В.М. Новиков В.Э. (Москва) Способ определения индивидуальной чувствительности человека к продуктам питания. Патент 2324942. 2008. + Для осуществления способа готовят тестовую и контрольную пробы путем добавления к заданному количеству цельной крови обследуемого пациента, содержащей антикоагулянт, соответственно экстракта анализируемого пищевого продукта и контрольного раствора в равных количествах. Полученные смеси перемешивают и помещают в лунки стандартного одноразового иммунологического планшета. Регистрируют динамику оседания клеток крови в контрольной и тестовой пробах путем измерения во времени интенсивности люминесценции плазмы крови над верхней границей слоя оседающих клеток. Увеличение интенсивности люминесценции при регистрации описанным способом линейно соответствует увеличению высоты столба прозрачного слоя плазмы крови над верхней границей оседающего слоя клеток крови лунке планшета. По результатам измерений получают зависимости изменения интенсивности люминесценции во времени для тестовой и контрольной проб, которые затем дважды дифференцируют, определяют значения времени, при которых вторая производная равна нулю, и при наличии достоверной разницы между ними диагностируют повышенную чувствительность к пищевому продукту.

Рис. 2-43. Зависимость интенсивности флуоресценции (вторая производная) от времени.

127

2.3. Флуоресценция крови для диагностики рака молочной железы.

2008 - Kalaivani R, Masilamani V, Sivaji K, Elangovan M, Selvaraj V, Balamurugan SG, Al-Salhi MS. (India) Fluorescence spectra of blood components for breast cancer diagnosis. Photomed Laser

Surg. 2008 Jun.26(3):251-257.+

Рассматривается диагностика рака молочной железы с помощью анализа спектра флуоресценции компонент крови. Возбуждение - 400 нм, Регистрируемый спектральный диапазон - 425-750 нм. Анализировались следующие пики флуоресценции: 639 нм - нейтральная форма порфиринов, 515 нм - базовая форма порфиринов, 465 нм - флавины, 465 - Рамановский пик.

Рис. 2-44. Флуоресценция компонент крови. А - норма, В - рання стадия рака, С - поздняя стадия рака.

128

2.4 Изменение свойств крови при онкологических заболеваниях.

Исследование крови широко применяется при диагностике онкологических заболеваний. При онкологии происходят существенные изменения различных переметров крови.

1-Изменяется рН крови,

2-Изменяется состав крови,

-уменьшается количество альбуминов, -повышается количество а1 и а2 глобулинов, -уменьшается альбумин/глобулиновый коэфициент

-повышается содержание церулоплазмина и в2-гликопротеина, -возрастает содержание фибриногена, -повышается отношение фибриногена к альбумину в венозной крови, -повышается содержание иммуноглобулинов, -уменьшается содержание бета-каротина,

-увеличивается содержание окисленных форм белков,

3-изменяется конформация альбумина, -снижается содержание сульфгидрильных групп,

-возникает агрегация молекул белка. В сыворотке крови молекулы альбумина существуют в виде мономеров и в виде олигомерных форм (дву-, три- и тетрамерных) форм.

-При поступлении в сыворотку ионов тяжелых металлов они соединяются с молекулой альбумина. При этом происходит экранирование поверхностных зарядов, и молекулы альбумина слипаются, агрегируют. Образуются нанокластеры из молекул альбумина.

-изменяется количество окисленных модификаций белков,

4-в крови появляются крупномолекулярные компоненты, присущие только онкологической патологии, -увеличивается количество молекул средней массы,

-изменяется липидный спектр,

5-Изменение четвертичной структуры альбумина приводит к увеличению гидратной оболочки молекулы.

Уменьшается количество свободной воды в крови. Увеличивается количество связанной воды в крови. Возрастает вязкость крови.

6-В крови появляются онкомаркеры, характерные белки,

7-Изменяется РОЭ (реакция оседания эритроцитов), СОЭ (скорость оседания эритроцитов).

У здорового человека оседание эритроцитов происходит плавно, и кривая на графике получается довольно гладкой, тогда как у больного она имеет большие колебания. Причем, как оказалось, каждому заболеванию соответствует определенная кривая.

8-Изменяется вязкость крови,

9-Изменяются оптические свойства крови: -показатель преломления, -спектр поглощения в видимой области, -спектр поглощения в УФ области, -ИК спектр поглощения,

-изменяются динамические характеристики ИК спектра,

129

-Рамановский спектр поглощения,

-флуоресценция.

При заболевании раком усиливается флуоресценция коферментов (NADN) (460 нм) по отношению к флуоресценции триптофана (350 нм) Увеличивается отношение интенсивностей флуоресценции I350/I460 при возбуждении светом с длиной волны 315 нм.

При заболевании раком увеличивается количество окисленных форм белков, что приводит к снижению интенсивности триптофановой флуоресценции на длине волны 336 нм.

-усиливается хемилюминесценция.

-исчезает митогенетическое излучение крови. Исчезновение свечения крови наблюдается и у здоровых лиц пожилого возраста, а также после физического и умственного переутомления, при голодании, некоторых интоксикациях, сепсисе и др. Обнаружение в крови онкологических больных ракового тушителя пептидной природы повысило диагностические возможности исследования митогенетического свечения крови. Установлено, что кровь больных со злокачественными новообразованиями и предраковыми заболеваниями обладает способностью тушить митогенетическое свечение.

8-В мембранах патологически измененных (раковых) клеток и в мембране эритроцитов происходит накопление протопорфиринов, которые флуоресцируют при 675 нм.

----------------------------------------------------------------------------

1914 - Петров Н.Н. Химические и биологические способы распознавания раковой болезни. Изд. Практическая медицина. 1914.

1938 - Данович Б.З. Советский врачебный журнал. Сб. 1080. 1938.

1949 - Гукасян А.Г. Клиническая медицина. 1949. №1. с.58

2000 - Ю. М. Лопухин и др. Конформационные изменения молекулы альбумина: новый тип реакции на патологический процесс. Бюл. эксперим. биол. и медицины. 2000. т.130. № 7. с.4-8.

130