6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Клиническая_лабораторная_диагностика_Учебник_В_В_Долгова_2016
.pdfбуферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску мазков.
Фиксация и окраска цитологических препаратов. Если мазки предполагается окрашивать по методу Папаниколау, их необходимо зафиксировать влажными, сразу после получения (влажная фиксация).
Фиксацию проводит специальными аэрозолями или фиксатором в капельной форме (фиксатор наносят на влажную поверхность мазка). Можно зафиксировать мазки, поместив их после получения в кювету в 96° этиловым спиртом на 10-20 минут. Затем мазки высушивают на воздухе.
Если мазки предполагается окрасить методом Романовского
(модификации Лейшмана, Май-Грюнвальд-Гимза, Паппенгейма), их после получения высушивают на воздухе (сухая фиксация). Если предполагается окрашивание гематоксилин-эозином, можно использовать как сухую, так и влажную фиксацию мазков.
В настоящее время все большее распространение получает метод жидкостной цитологии. Главным отличием данного метода от традиционного является то, что материал не наносят сразу на стекло, а помещают во флакон со стабилизирующим раствором. Быстрое консервирование материала позволяет предотвратить бактериальное засорение образца, повреждение клеток вследствие их высыхания, сохраняет образец в оптимальных условиях для дальнейшей его транспортировки в лабораторию и исследования.
Стабилизирующий раствор обеспечивает сохранение морфологических,
иммуноцитохимических и генетических свойств клеток. Полученный материал можно использовать для проведения молекулярно-диагностических исследований.
Приготовление толстой капли. Толстые капли после высушивания на воздухе окрашиваются краской Романовского-Гимза без предварительной фиксации. При этом происходит выщелачивание (гемолиз) гемоглобина из эритроцитов, и окрашиваются лейкоциты, кровяные пластинки и плазмодии.
Если толстые капли сохраняли неокрашенными более недели, то их следует
91
предварительно обработать дистиллированной водой в течение 10-15 мин,
наливая воду непосредственно на препарат. Удалив со стекол дистиллированную воду вместе с выщелоченным гемоглобином, на них наливают красящий раствор. После окраски толстой капли препараты ополаскивают водой. Лучше всего промывать препарат, погружая его в баночку с водой, соблюдая осторожность, чтобы не смыть со стекла окрашенную каплю.
2.4.2. Обогащение препаратов методами флотации, седиментации
Методы обогащения широко используются при паразитологических
исследованиях. В частности, использование методов обогащения показано во всех случаях, когда исследование нативных препаратов дает отрицательные результаты, а клинические и анамнестические данные указывают на паразитарную инвазию. Для исследования могут использоваться как свежевыделенные каловые массы, так и законсервированные.Метод флотации заключается в накоплении,
в частностияиц, гельминтов в поверхностной пленке при суспендировании каловых масс. Флотационные методы дают хорошие результаты, в
особенности для обнаружения легких яиц власоглава, аскариды,
анкилостомид и карликового цепня, в то время как крупные и тяжелые яйца трематод могут долго не всплывать и скапливаться в осадке.
Седиментационные методы традиционные основаны на оседании
«тяжелых» объектов (яиц и личинок гельминтов) в осадке на дне пробирки в легкой инкубационной среде (раствор этилацетата). Метод позволяет обнаруживать яйца и личинки гельминтов, а так же цисты простейших.
Имеются коммерческие одноразовые наборы для концентрации яиц и личинок гельминтов методом седиментации. Парасеп – готовый к использованию пластиковый одноразовый комплект, содержащий необходимое количество этилацетата, забуференного физ.раствора и формалина, и состоящий из круглодонной пробирки, встроенного фильтра и конусной (центрифужной) пробирки.
92
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
Помимо прямых копроовоскопических методик, флотационных и седиментационных методов обогащения, в КДЛ проводится исследование материала, полученного с использованием специальных методов,
направленных на выявление конкретных возбудителей гельминтозов. К ним относятся метод обнаружения остриц в перианальных складках с помощью перианального соскоба/отпечатка (различные модификации), метод обнаружения личинок кишечной угрицы (метод Бермана и его модификации).
2.4.3. Цитоцентрифугирование
Цитоцентрифугирование – технология, основой которой является нанесение тонкослойного клеточного препарата на слайд из пробы,
полученной при использовании жидкостной цитологии во время горизонтального центрифугирования в системах специальной конструкции,
где цитокамеры герметично соединены с поверхностью слайдов. Процесс осаждения клеток на слайд под действием центростремительной силы происходит аналогично процессу в центрифужной пробирке. Технология
CytoSpin реализуется при использовании специальной цитоцентрифуги,
которая имеет ряд моделей цитокамер сложной конструкции,
предназначенных для различных объемов и концентрации проб и несколько рабочих каналов для создания от 2 до 8 рабочих зон на одном препарате.
Этапы технологии цитоцентрифугирования включают: получение пробы,
перемешивание пробы, проведение дополнительных операций по улучшению качества цитологического препарата непосредственно в цитокамере (отмывка и осветление клеточных суспензий, лизис эритроцитов, разделительное центрифугирование в градиентном растворе, коррекция концентрации клеток), дозирование пробы в герметичную систему из цитокамеры и слайда,
горизонтальное центрифугирование с осаждением клеточных элементов на слайд и получением препаратов для фиксации и окраски (возможна фиксация и окраска слайдов непосредственно в цитокамере), высушивание препарата в
93
специальной подвеске центрифуги за счет эффективной системы вентиляции,
возникающей при вращении ротора. Применение этой технологии на преаналитическом этапе возможно в любых областях с цитологии и комплексных диагностических схемах. Цитоцентрифугирование – технология, обеспечивающая сохранность клеток для исследования и получение высококачественных тонкослойных препаратов на слайдах любого типа и покрытия. Эта технология позволяет: работать с живыми клетками или осуществлять их фиксацию; использовать разные объемы проб и концентрации клеток; удалять мешающие микроскопии факторы; –
создавать от 1 до 8 зон для исследования на одном слайде; применять разные способы окраски или внесения зондов и иммунохимических маркеров.
2.4.4. Автоматизация этапа пробоподготовки
Процесс производства лабораторных анализов включает ряд процедур,
связанных с внутрилабораторной идентификацией образца и подготовкой биологического материала к исследованиям. Данный этап включает снятие крышек с приспособлений, в которых находится биоматериал,
центрифугирование проб, приготовление и окраску мазков; дополнительную сортировку и доставку подготовленных проб на автоматические анализаторы для проведения исследований. Автоматизация и стандартизация перечисленных процедур имеет не менее важное значение в работе по непрерывному повышению качества результатов лабораторных исследований, чем автоматизация процесса их выполнения на автоматических анализаторах.
Лабораторная автоматизированная система (ЛАС) – это комплекс программных и технических средств, предназначенных для автоматизации различных технологических операций, связанных с производством лабораторных анализов. ЛАС могут включать в себя следующие устройства:
автоматического сбора доставленных проб;
переносчики проб;
94
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
сканирующее устройство для идентификации проб по штрих-кодам;
автоматические центрифуги; загрузку в центрифугу производят автоматически, после центрифугирования пробы возвращают в систему транспортировки проб;
детектор уровня сыворотки определяет уровень сыворотки в каждой пробирке, информация об уровне сохраняется в системе для дальнейшего использования в устройстве дозирования проб на порции;
устройство удаления крышек; крышки, закрывающие пробирки,
автоматически удаляются и помещаются в специальный контейнер,
отвечающий требованиям безопасного хранения;
устройство для нанесения штрих-кода предназначено для нанесения штрих-кода на вторичные пробирки;
устройство деления проб на порции; сыворотка автоматически переносится в нужном количестве из первичной пробирки в одну или несколько вторичных пробирок;
выходной модуль; пробирки автоматически помещаются в выходное устройство, при этом производится сортировка по лабораторным анализаторам и по срочности тестирования. 8.3. Основными целями внедрения ЛАС в КДЛ являются стандартизация технологических операций подготовки биоматериала к исследованиям, исключение контакта персонала
сбиоматериалом и увеличение производительности труда. Лаборатория может использовать 2 подхода для автоматизации:
комплексные, или тотальные, лабораторные автоматизированные системы;
модульная, пошаговая автоматизация отдельных процессов в лаборатории или отделов лаборатории.
Комплексные лабораторные автоматизированные системы предназначены для полной автоматизации всех этапов процесса получения результатов лабораторных исследований в КДЛ. Внедрение комплексных
95
ЛАС в КДЛ обосновывается необходимостью проведения большого или очень большого объема лабораторных исследований (более 5-7 млн. тестов в год). Комплексные ЛАС требуют больших финансовых затрат, которые окупаются не менее чем через 2-3 года. Они экономически не выгодны для средних и малых КДЛ. Основным направлением автоматизации для КДЛ,
выполняющих менее 5`000`000 лабораторных анализов в год, является модульная пошаговая автоматизация. Модульная автоматизация позволяет решать проблему создания современной автоматизированной лаборатории при помощи ряда последовательных шагов. При осуществлении модульной автоматизации первый шаг – установка анализатора для проведения анализов в автоматическом режиме. Следующим шагом может быть подключение к анализатору роботизированной станции для загрузки проб в анализатор и их выгрузки. В дальнейшем можно будет осуществить подключение роботизированной станции к линии транспортировки, в результате будет достигнута комплексная автоматизация процесса производства данного вида анализов.
2.5.Аналитический этап лабораторного анализа
2.5.1.Техника основных манипуляций при выполнении лабораторного
анализа
Техника дозирования жидкостей. Дозирование пробы и реагентов – обязательный этап большинства аналитических процессов. Точность дозирования напрямую влияет на точность получаемого результата.
Практически все дозаторы, применяемые в КДЛ, используют один из двух
методов:
1. Метод прямого дозирования – сначала жидкость заполняет точно заданный объем, а затем она максимально полно извлекается из этого объема в пробирку. При пипетировании нажимают на головку плунжера большим пальцем до первой остановки. Погрузив наконечник пипетки в раствор,
медленно освобождают плунжер. В наконечник набирается необходимый
96
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
объем жидкости. Для того чтобы слить жидкость, повторно нажимают на головку плунжера, но теперь уже до второй остановки, то есть до упора. При этом из наконечника удаляются все остатки жидкости. Затем палец подымают, плунжер возвращается в исходное положение
2. Метод обратного дозирования – жидкость заполняет больший объем, а затем из устройства извлекается строго заданное количество жидкости. При обратном способе пипетирования нажимают на головку плунжера большим пальцем до упора. Погружают наконечник пипетки в раствор и медленно освобождают плунжер. В наконечник набирается объем жидкости, но несколько больший, чем необходимо. Для дозировки заданного объема нажимают на головку плунжера только до первой остановки.
Остающаяся после этого в наконечнике часть жидкости в измеряемый объем не входит. Ее необходимо удалить, что осуществляют дожатием плунжера до упора. Затем освобождают палец и плунжер возвращается в исходное положение. Обратным способом удобно пользоваться при дозировке легко пенящихся и вязких жидкостей.
При использовании стеклянных пипеточных дозаторов лаборант визуально следит за заполнением жидкостью объема пипетки, стараясь,
чтобы мениск точно совпал с градуировочной риской, нанесенной на пипетке. Основной недостаток этой технологии – большая зависимость точности дозирования от мастерства и внимательности лаборанта.
Автоматические пипетки служат для скоростного манипулирования при отборе и дозировании жидкостей, представляют собой устройство с пневматическим механизмом, действие которого основано на вытеснении жидкости воздухом. По конструктивным особенностям автоматические пипетки можно характеризовать по следующим основным группам:
механические и электронные, одноканальные и многоканальные,
фиксированного и переменного объема.
Механические автопипетки снабжены пружинным механизмом и дозирующим устройством – микрометрическим винтом. Приводятся в
97
действие вручную. В электронных пипетках пневматический механизм управляется микропроцессором с электропитанием от аккумуляторов.
Одноканальные автопипетки нашли наибольшее применение в лабораториях.
Многоканальные автопипетки по производительности значительно превышают одноканальные, но область их применения ограничена рамками узкоспециальной аппаратуры. Это определяет конфигурацию их концевой части. Чаще всего в лабораториях используются многоканальные пипетки для иммунологических исследований, которые рассчитаны на работу с плашками строго определенных параметров.
Точность и воспроизводимость измерений, выполняемых автопипетками, колеблется в пределах от ±0,5% до ±3%, в зависимости от типа автопипеток. Автопипетки, как правило, не увеличивают точность дозирования, они лишь облегчают и ускоряют работу. Поэтому для точных аналитических целей предпочтительно использовать калиброванные по объему (взвешиванием на аналитических весах объема дозирования дистиллированной воды) стеклянные пипетки.
Имеются ограничения на величину дозирования, особенно при ручном исполнении. При работе с биологическим материалом с разной плотностью
(кровь, плазма, сыворотка крови, моча, слюнная жидкость и т.д.)
рекомендуется при ручном дозировании использовать объемы не менее 3-5
мкл. Учитывая, что при проведении биохимических, иммунохимических исследований соотношение биопроба/реагент, как правило, находятся в соотношении 1:10-1:100, объем реакционной смеси (кювет) не должен быть меньше 300-500 мкл.
Первоначальная калибровка дозаторов проводится на предприятии-
изготовителе. Калибровка в условиях лаборатории должна осуществляться дистиллированной водой при температуре +22 градуса, и для калибровки требуются аналитические весы с точностью порядка 0,001 мг.
В лабораторных анализаторах дозирование осуществляется за счет работы шаговых двигателей, использования многоканальных наконечников
98
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
(обеспечивают смыв реагентов с поверхностей) и сложных схем дозирования,
при которых больший объем реагента смывает всю биопробу. Стандартное гарантированное дозирование в лабораторных анализаторах позволяет работать с объемами менее 1 мкл и существенно сократить количество используемых реагентов.
Техника взвешивания. В клинико-диагностических лабораториях взвешивание проводят на аналитических весах, предназначенных для определения массы тел с высокой точностью. Работают с образцами небольших объёмов. Весы позволяют определять массу порошков,
жидкостей, твёрдых тел, а также небольших по размерам животных.
Высокая дискретность (точность) аналитических весов в 0,01 мг достигается за счёт использования технологического решения – электромагнитной компенсации, благодаря чему происходит мгновенный отклик на изменения массы. Точность измерений также обеспечивают ветрозащитные экраны с автоматизированным или ручным приводом, а
заряды статического электричества нейтрализуются встроенным либо устанавливаемым дополнительно ионизатором. Устройства имеют двунаправленные интерфейсы, что позволяет подключать компьютер,
принтер, сохранять данные на флеш-карты.
Калибровка аналитических весов может проводиться несколькими способами. Во многих моделях предусмотрен механизм автоматической калибровки при помощи встроенных гирь. Также возможна ручная внешняя калибровка – для этого дополнительно приобретаются эталонные гири.
Калибровка необходима при каждом перемещении устройств с места на место, при изменении температуры окружающей среды, толчках, ударах,
вибрации и т. д.
Техника фильтрации. Фильтрование жидкостей в лаборатории проводят с помощью воронок, в которые вкладывается специальная фильтровальная бумага. Фильтрование осуществляется либо в режиме постоянной разности давлений (например, вакуум-фильтры), либо в режиме
99
постоянной скорости. Все современные способы очистки можно разделить на две большие группы: механические фильтры, являющиеся перфорированной перегородкой той или иной конструкции, и очистители в силовых полях
(гравитационные, центробежные, магнитные, электростатические).
Недостатком первых является малая грязеёмкость, увеличение перепада давления по мере забивания отверстий или пор в перегородке, ограничения по степени загрязнённости, подаваемой на очистку жидкостей, большие габаритные размеры, увеличивающиеся по мере увеличения пропускной способности или тонкости очистки. Всё это приводит к необходимости периодической замены или регенерации фильтрующего элемента.
Центрифугирование. Центрифугированию подвергается различный материал, поэтому эта процедура должна быть строго стандартизована. При лабораторных исследованиях общим правилом для всех видов проб является требование как можно быстрее отцентрифугировать доставленный материал.
Для биохимических исследований (сыворотка) практически приемлемым является интервал 2 ч между взятием крови и центрифугированием. Кровь должна находиться в закрытых пробирках, крышки с пробирок перед центрифугированием не снимают.
Перед проведением центрифугирования проверяют, все ли пробирки,
стаканы для них, вкладыши одинаковы по весу, форме и величине. Это делается для того, чтобы «плечи» ротора центрифуги были уравновешены.
Если количество крови в пробирках разное, то подбирают одинаковые пары пробирок и каждую из них устанавливают в симметричные противоположные гнезда ротора центрифуги. Для соблюдения симметрии можно использовать пробирку с нужным количеством воды в противоположном гнезде.
Объемы, которые можно центрифугировать, варьируют в зависимости от модели центрифуги и конструкции ее ротора. При выборе оптимальных условий центрифугирования необходимо ориентироваться на центробежную силу (g), а не на скорость вращения ротора (обороты в минуту). К паспорту
100
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/