6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Клиническая_лабораторная_диагностика_Учебник_В_В_Долгова_2016
.pdfактивность наблюдается в плазматических клетках, мегакариоцитах,
тромбоцитах, моноцитах и макрофагах, гранулоцитарных предшественниках.
По мере созревания клеток нейтрофильного и эозинофильного рядов активность КФ снижается. КФ в основном локализуется в первичных гранулах и отсутствует во вторичных. Зрелые нейтрофилы и эозинофилы обладают низкой ферментативной активностью, либо они лишены ее. В
лимфоцитах активность КФ весьма вариабельна. Положительная окраска проявляется в плазматических клетках, Т-лимфоцитах и особенно бластных клетках при Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе, плазмоцитоме,
волосатоклеточном лейкозе (ВКЛ). Снижение активности КФ в лимфоцитах отмечается при ХЛЛ и неходжкинских злокачественных лимфомах,
увеличение – при инфекционном мононуклеозе.
Клиническое значение. Определение активности КФ имеет значение в диагностике волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ). Часто при ВКЛ в клетках выявляется тартратрезистентная кислая фосфатаза (изофермент 5).
Активность КФ в лимфоцитах при лимфоме маргинальной зоны селезенки низкая или отсутствует.
Щелочная фосфатаза. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ)
присуща только зрелым клеткам гранулоцитарного ряда, преимущественно нейтрофилам. Изредка в эозинофилах имеет место фоновая окраска цитоплазмы, но не гранул. Базофилы не содержат ЩФ как в норме, так и при патологических состояниях. В лимфоцитах, моноцитах, эритроцитах и тромбоцитах реакция на ЩФ отрицательная.
Клиническое значение. Определение активности щелочной фосфатазы
(СЦК) применяется для дифференциации хронического миелолейкоза (ХМЛ)
от других миелопролиферативных заболеваний и реактивных изменений в гемограмме. Активность ЩФ увеличивается при истинной полицитемии,
идиопатическом миелофиброзе, бактериальных инфекциях и резко снижаются при ХМЛ. Низкие показатели ЩФ почти всегда обнаруживаются при Ph-положительном ХМЛ, а также при Ph-отрицательном ювенильном
241
ХМЛ. Лишь гемолитическая и железодефицитная анемии или некоторые вирусные заболевания показывают сравнительно низкий СЦК. У больных с ХМЛ в период ремиссии может отмечаться нормальная или даже повышенная активность ЩФ.
Окраска на сидеробласты. Сидеробласты и сидероциты – это нормобласты (эритробласты) и эритроциты, содержащие в цитоплазме негемоглобиновое железо в виде гранул. Если гранулы свободного железа многочисленные, грубые и располагаются вокруг ядра, образуя кольцо, то такие клетки называются «кольцевидными сидеробластами».
Соединения железа обычно не обнаруживаются в лейкоцитах, тогда как выявление их в эритрокариоцитах информативно для изучения неэффективного эритропоэза и диагностики некоторых вариантов МДС. При этих заболеваниях железо, поступающее в эритробласты, не используется для синтеза гемоглобина и откладывается в эритрокариоцитах, в костномозговых макрофагах в виде гемосидерина или ферритина. Исследование сидеробластов в костном мозге дает полезную информацию для оценки адекватности накопления железа в организме.
Клиническое значение. Истощение запасов железа происходит при железодефицитной анемии и сопровождается снижением количества сидеробластов. Избыточное накопление наблюдается при идиопатическом и приобретенном гемохроматозе, хронической гемолитической анемии,
талассемии и МДС, что приводит к увеличению числа сидеробластов. При диагностике МДС отличительным признаком РАКС (рефрактерной анемии с кольцевидными сидеробластами) является присутствие в костном мозге более 15% кольцевидных сидеробластов.
Оценка результатов цитохимических реакций. Значение
цитохимических реакций в онкогематологии. Основное применение цитохимические методы находят в диагностике гемобластозов.
Использование стандартной панели цитохимических методов – МПО,
липидов, PAS-реакции, реакции на неспецифическую эстеразу – в
242
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
большинстве случаев бывает достаточной для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток, и таким образом для определения варианта острых лейкозов и бластного криза при хроническом миелолейкозе
(ХМЛ). В некоторых случаях цитохимические реакции позволяют определить принадлежность клеток к опухолевому клону (определение тартрат-резистентной фракции кислой фосфатазы при волосатоклеточном лейкозе).
Цитохимические реакции в онкогематологии используются для:
–установления варианта острого лейкоза и бластного криза ХМЛ;
–дифференциальной диагностики идиопатического миелофиброза
(сублейкемического миелоза) и ХМЛ;
–диагностики волосатоклеточного лейкоза и лимфомы селезенки с отростчатыми лимфоцитами;
–выявления особенностей метаболизма лейкозных клеток.
Цитохимическими маркерами бластов гранулоцитарного ряда являются МПО, липиды и AS-D-хлорацетатэстераза. Содержание этих ферментов в миелобластах сильно варьирует. В некоторых случаях может выявляться 1
или 2 из перечисленных маркеров (чаще липиды). Поэтому, для избегания ошибочного заключения при получении сомнительного результата реакции необходимо проведение двух реакций. Активность AS-D-хлорацетатэстеразы существенно ниже, чем активность МПО, поэтому определение этого фермента представляет меньшую диагностическую ценность. Следует учитывать, что активность МПО у детей до 15 лет и пациентов старше 60 лет ниже, чем у лиц среднего возраста.
Для идентификации монобластов главную роль играет определение неспецифической эстеразы, подавляемой фторидом натрия. Для лимфобластов характерно наличие отрицательной реакции на МПО и положительной PAS-реакции в гранулярной форме.
Оценка активности ферментов в клетке возможна с использованием компьютерного анализа изображения. Применение компьютерного метода в
243
цитохимии позволяет объективизировать исследование, перейти от
описательного метода оценки ферментов в клетках к полуколичественным
измерениям.
3.3.6. Проточная цитофлюориметрия, ее диагностическое значение
Проточная цитометрия – современная технология быстрой оценки частиц или клеток в процессе их продвижения в потоке жидкости.
Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременно многоцветный анализ, когда каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет одной длины волны.
Основными задачами проточной цитометрии являются количественная и функциональная характеристика клеток с характеристикой:
поверхностные антигены;
внутриклеточные цитоплазматические молекулы — цитокины,
бактерицидные белки, сигнальные молекулы, белки цитоскелета);
внутриклеточные ядерные молекулы (транскрипционные факторы,
ядерные белки, ДНК и ее фрагменты, РНК, хромосомы, мембранный потенциал митохондрий, концентрация ионов кальция, активность ферментов и т.д.);
продукция цитокинов;
оценка абсолютного числа CD4+ Т-лимфоцитов в стадировании течения ВИЧ-инфекции.
Проточная цитофлюориметрия играет ключевую роль в онкогематологии. Она используется с целью диагностики и мониторирования опухолевой популяции при острых лейкозах и лимфопролиферативных заболеваниях (ЛПЗ), прогноза, подсчета абсолютного количества стволовых гемопоэтических клеток, используемых для последующей аутотрансплантации, диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии.
Основные диагностические возможности иммунофенотипирования в
онкогематологии представлены в табл. 3.10.
244
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
|
Таблица 3.10 |
Возможности проточной цитофлюориметрии |
|
|
|
Клиническое значение |
Потенциальные возможности |
Диагностика ОЛЛ и ОМЛ (М0, М6, М7); |
Идентификация вариантов острых |
бифенотипического острого лейкоза |
лейкозов с неблагоприятным прогнозом |
Диагностика и дифференциальная |
Выявление минимальной остаточной |
диагностика В-клеточных |
болезни при острых лейкозах и ЛПЗ |
лимфопролиферативных заболеваний (ЛПЗ) |
|
Диагностика Т-клеточных ЛПЗ |
Подсчет гемопоэтических стволовых |
|
клеток пуповинной и периферической |
|
крови, костного мозга |
На основе концепции соответствия фенотипа злокачественной клетки фенотипу нормального клеточного аналога на каждом уровне дифференцировки представилось возможным выделить ряд иммунологических вариантов (фенотипов), определяющих клеточную природу лейкозов, уровень блока дифференцировки клетки в лейкемической популяции. В большинстве случаев острых лейкозов бласты имеют иммунофенотип, сравнимый с нормальными гемопоэтическими клетками аналогичных стадий дифференцировки. При ОЛЛ и ОМЛ бластные клетки рассматриваются как злокачественные аналоги нормальных клеток на ранних стадиях лимфо- и миелопоэза. По набору мембранных и цитоплазматических антигенов можно установить линейную принадлежность, стадию дифференцировки и функциональное состояние клетки. Выделяют:
линейно не ограниченные (не рестриктированные) антигены – их экспрессия не ограничена одной клеточной линией. Это CD34, CD38, HLADR, TdT;
линейно-ассоциированные (линейно-специфические) антигены –
специфически экспрессируются на некоторых линиях миелоидной (CD13, CD33, CD117, CD65, MПO, CD14, CD15, CD41, CD42, CD61 и т.д.) или лимфоидной дифференцировки (CD19, CD22, cIg, sIg, CD5, CD3 и т.д.);
дифференцировочные антигены – отражают стадии дифференцировки клеток (цитоплазматический IgМ, , -легкие цепи Ig, CD34, CD10, СD1а);
245
активационные антигены – отражают активацию клеток (CD25,
CD38, HLA-DR).
Дифференцировочные антигены могут обнаруживаться на злокачественных клетках в комбинациях, которые очень редко встречаются или не выявляются в нормальном костном мозге.
Лейкемические клетки можно отличить от их нормальных аналогов по ряду критериев. К основным типам фенотипа лейкозных клеток относятся:
коэкспрессия антигенов нескольких линий, т.е. лимфоидных маркеров при ОМЛ или миелоидных маркеров при ОЛЛ;
асинхронная экспрессия антигена – одновременная экспрессия
«раннего» и «позднего» антигенов, которые в норме находятся на разных этапах дифференцировки клеток, например, CD34 и CD15; CD15 и CD117;
сверхэкспрессия антигена – плотность распределения антигенов на лейкозной клетке больше, чем на нормальной клетке костного мозга
(например, гиперэкспрессия CD10 при ВII ОЛЛ);
отсутствие или низкий уровень экспрессии антигена, характерного для данной стадии дифференцировки — потеря клеткой ряда поверхностных антигенов, например, утрата CD33 наблюдается в 21% случаев ОМЛ;
фенотипический профиль, практически не встречающийся в норме.
Измененная экспрессия антигенов отражает генетические нарушения,
лежащие в основе опухолевого перерождения клетки, позволяя выявлять атипичные клетки даже при относительно небольшом их содержании в образце. Подобный иммунофенотип лейкозной клетки позволяет проводить мониторинг за остаточной опухолевой популяцией в процессе химиотерапии.
Проточная цитофлюориметрия позволяет исследовать антигены,
имеющие прогностическое значение, например, CD38, ZAP-70, CD31 при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Широкое использование в клинической практике моноклональных антител (мабтера, кэмпас,
люмиксимаб и др.) значительно улучшило результаты лечения больных
246
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
лимфомами. Для успешного их применения необходимо до начала терапии исследовать степень экспрессии антигенов на соответствующих клетках-
мишенях (например, CD20 или CD52 при использовании соответственно мабтеры и кэмпаса). В динамике лечения, используя метод проточной цитофлюориметрии, можно проводить мониторинг остаточной популяции опухолевых клеток. Подсчет гемопоэтических стволовых клеток на основании идентификации антигена CD34 широко используется в клинической гематологии, так как они обеспечивают постепенное восстановление костного мозга после интенсивной химиотерапии.
Широкое использование проточной цитофлюориметрии в онкогематологии привело к качественно новой диагностике лейкозов и лимфом, а также к разработке новых подходов в оценке эффективности лечения и мониторинга минимальной остаточной болезни, определяющей дальнейшую тактику ведения больных.
3.3.7. Цитогенетические и молекулярные исследования, диагностическое
значение
Материалом для исследования обычно служат метафазные или прометафазные клетки, накопленные in vitro. Цитогенетики, изучая кариотипы этих клеток, стремятся определить связь их изменений с фенотипическими проявлениями заболевания и установить вклад перестроек хромосом в обоснование диагноза заболевания и прогноза его течения.
Стандартное цитогенетическое исследование дифференциально окрашенных метафазных хромосом имеет ряд объективных ограничений: неоднородность клеточной популяции в отношении митотической активности, индекса спирализации и плохого расхождения хромосом; недоступность для анализа клеток, находящихся в интерфазе. В процессе предварительного культивирования возможен избирательный выход в митоз клеточных клонов,
имеющих селективные преимущества роста, что также искажает получаемые результаты. Кроме того, репрезентативность классической цитогенетики из-
247
за трудоёмкости её методов невысока: обычно исследуют не более 15-20
метафазных пластинок. Цитогенетики все шире используют молекулярные методы кариотипирования, к которым относят:
гибридизация in situ с использованием специфических проб к центромерам;
метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISН) с помощью специфических ДНК-зондов;
метод мягкой гипотонической обработки, оставляющей сохранными клеточную мембрану и цитоплазму клетки и фиксация кислотой или формальдегидом перед иммунохимией (МАС-морфология, антитела,
хромосомы);
метод многоцветного спектрального кариотипирования (SKY).
Метод MAC может быть комбинирован с гибридизацией in situ
(MACISH), и тогда интерфазные клетки становятся легко обрабатываемым материалом, особенно при заболеваниях, где получить метафазные пластинки трудно. FISН-метод позволяет относительно быстро исследовать сотни интерфазных ядер или метафазных пластинок низкого морфологического качества для выявления перестроек того или иного гена. С
помощью SKY-метода проводят анализ всего хромосомного набора в одном эксперименте.
В гематологии применение метода FISH особенно перспективно при лимфопролиферативных заболеваниях с низким митотическим индексом или при Рh-негативных вариантах хронического миелолейкоза, когда этот метод становится единственно возможным для выявления химерного гена bсr/аbl, а
также при дифференциальной диагностике с другими миелопролиферативными заболеваниями или оценке эффективности терапии. Детальная цитогенетическая характеристика для прогнозирования течения заболевания часто невозможна из-за сложности и множественности хромосомных перестроек. Тогда полезно использовать многоцветное
248
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
спектральное кариотипирование (SKY) с ДНК-зондами на весь хромосомный набор клетки.
С помощью ДНК-зондов и гибридизации in situ не только определяют хромосомные перестройки, но и проводят генное картирование. Получили распространение пренатальная диагностика и мониторинг беременности. В
настоящее время цитогенетическую «прописку» на хромосомах человека получили около 1500 клинических состояний, среди которых предрасположенность к заболеваниям, болезни с конституциональными хромосомными перестройками (идентифицированными или предполагаемыми), злокачественные новообразования (солидные опухоли и гемобластозы), заболевания, ассоциированные с мутациями митохондриальной ДНК. Нет сомнения в том, что хромосомные аберрации маркируют аномалии полового созревания и некоторые наследуемые патологические состояния. Предприняты попытки создания регистра генных компонентов и полигенной специфики таких заболеваний, как диабет и психозы.
Накоплена обширная информация о значительном числе хромосомных нарушений, специфичных для ряда гемобластозов. Выявлен клоновый характер изменений кариотипа гемопоэтических клеток, лежащий в основе развития лейкозов и лимфатических опухолей. Цитогенетический анализ в гематологии стал играть важную роль в диагностике, прогнозировании течения заболеваний и оценке эффективности применяемой терапии.
Изменения хромосом при заболеваниях системы крови сложны и затрагивают как количественный состав наборов – численные аберрации, так и структуру отдельных хромосом – структурные аберрации. При типичных для острых и хронических гемобластозов хромосомных аберрациях смена локализации или повреждение структуры генов может приводить к нарушению их экспрессии или к структурно-функциональным изменениям кодируемых ими белков. По-видимому, эти изменения играют интегральную роль в патогенезе, а возможно и в прогрессии лейкоза.
249
При хроническом миелолейкозе, хроническом лимфолейкозе,
хроническом миеломоноцитарном лейкозе, В-лимфосаркоме хромосомные аберрации типа t(9:22), t(5:12), t(14; 19), t(14; 18) приводят к перестройкам bcr, abl, tel или bcl генов, химерные белковые продукты которых, меняя характер клеточной пролиферации (при этом, не являясь трансформирующим сигналом), делают клетки бессмертными.
При острых лейкозах повреждения хромосом с локализацией 11q23
(острые лимфоидные и миелоидные лейкозы), 15q22 и 17q12 (острый промиелоцитарный лейкоз и реже – бластный криз хронического миелолейкоза), а также 21q22 (острый миелобластный лейкоз, бластный криз ХМЛ), как правило, видоизменяют генетические факторы транскрипции
(MILL, PML, RAPA, AML) и тем самым нарушают клеточную и тканевую дифференцировку, создавая базу для злокачественной трансформации клеток.
Кроме перечисленных хромосомных аберраций при лейкозах часто регистрируют мутации генов. Так, мутации семейства протоонкогенов RAS
бывают в 4% случаев ХМЛ на стадии развёрнутых проявлений заболевания,
и в 26% ОМЛ (чаще при остром миеломонобластном лейкозе), сочетаясь с большей продолжительностью жизни больных. Примерно у 20% больных острыми нелимфоцитарными лейкозами отмечены мутации протоонкогенов
FMS (локализованы на хромосоме 5q33) и повышение тирозинкиназной активности. При ХМЛ частые мутации протоонкогена ТР53 (хромосома
17р13), т.е. утрата аллеля гена р53, как правило, сочетаются с бластной трансформацией хронической стадии лейкоза.
3.4. Реактивные изменения крови
Реактивные изменения включают изменения количества клеток в крови, необычную морфологию клеток, а также изменения в кроветворных органах. В большинстве случаев подразумевается увеличение содержания клеток в крови (лейкоцитоз, эритроцитоз, тромбоцитоз), изменения крови
250
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/