6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Клиническая_лабораторная_диагностика_Учебник_В_В_Долгова_2016
.pdfметода заключается в многократном копировании (амплификации)
определенных, специфических только для данной мишени участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-
полимеразой. Благодаря этому происходит увеличение концентрации специфических для данной мишени фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды,
имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
Taq-полимераза – термостабильный фермент (максимальная активность фермента проявляется при темп. 70-74ºС (хотя фермент может работать и при более низких температурах). Источник происхождения этого фермента – микроорганизм Thermus aquaticus, время полужизни при 94 С составляет около 45 мин. Taq-полимераза обеспечивает достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ),
дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и
дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – «строительный материал»,
используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации,
обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Анализируемый образец – это подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК,
например ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего
141
многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
В идеальных условиях проведения реакции за 35 циклов ПЦР синтезируется несколько миллиардов копий ампликона определенной длины.
Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента, например, с помощью флюориметрии или методом электрофореза в агарозном геле.
Клоттинговые методы исследования гемостаза. Клоттинговые или коагуляционные методы основаны на определении промежутка времени от добавления стартового реактива, запускающего каскад свертывания плазмы,
до момента образования сгустка (выпадения фибрина). При постановке коагуляционных тестов необходимо перемешать плазму с реактивом до гомогенной суспензии и поддерживать стабильной температуру реакции.
Коагуляционные тесты в настоящее время наиболее распространенный методический подход для оценки плазменного гемостаза в клинико-
диагностических лабораториях. Коагуляционные методы являются скрининговыми, тем не менее, на основе их сконструирован ряд методов для оценки активности факторов плазмы. Разработаны и активно применяются амидолитические тесты с хромогенными субстратами, часто дублирующие клоттинговые тесты. Тем не менее, клоттинговые являются приоритетными и выполняют роль референтных при анализе плазменного гемостаза.
Клоттинговые методы практически повсеместно автоматизированы и выполняются на коагулометрах. Это значительно расширило возможности оценки гемостаза в клинико-диагностических лабораториях. В то же время это требует качественного улучшения преаналитического этапа, жестких требований к пробоподготовке.
Коагулометры. В основе регистрации момента выпадения сгустка в коагулометрах используются несколько принципов: механический,
турбидиметрический, оптико-механический.
142
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
Механические коагулометры. Принцип работы механических коагулометров представлен на рис. 2.13. В одном из вариантов кювета с плазмой вращается в наклонном положении. Металлический шарик в кювете начнет вращаться при свертывании плазмы. Момент захвата шарика выпавшим сгустком и начало его вращения вместе с кюветой фиксируется магнитным датчиком. При других вариантах регистрируется прекращение вращения внутри кюветы магнитной мешалки, захват сгустка опускающимся
вкювету крючком или иные схемы, основанные на переходе жидкой плазмы
всгусток. Механические коагулометры характеризуются высокой надежностью и простотой в обслуживании. Принципиально то, что механические коагулометры могут работать на цельной крови. Основные проблемы возникают в ситуациях, когда формируется неплотный сгусток,
например при использовании гепарина. В этих случаях выпадающий фибрин часто не может сразу увлечь за собой механическое устройство, результаты получаются плохо воспроизводимыми. Другой проблемой является формирование на шарике, мешалке или других устройствах, погруженных в кювету, белковых конгломератов, которые мешают регистрации.
Рис. 2.13. Принцип работы механического коагулометра. Кювета с плазмой расположена под наклоном и вращается, шарик стоит на месте, не вращается. В момент свертывания шарик захватывается сгустком, как только шарик уходит от датчика меняется магнитное поле, прибор регистрирует момент свертывания плазмы
143
Оптико-механические коагулометры. Коагулометры этого класса характеризуются способностью регистрировать выпадающие хлопья фибрина даже без формирования плотного сгустка, что бывает при приеме пациентами антикоагулянтов, а также в случаях коагулопатий. Принцип оптико-механического коагулометра представлен на рис. 2.14. За счет использования следящей схемы регистрируется изменение подаваемого на лампу напряжения, чтобы обеспечивался заданный световой поток,
проходящий через кювету с образцом. В этом случае резко уменьшается влияние исходной плотности плазмы, ее иктеричности и липемичности, в
принципе, возможно исследовать свертывание плазмы с тромбоцитами.
Рис. 2.14. Принцип регистрации выпадающего фибрина оптико-механическим коагулометром. Выпавшие в кювете нити фибрина меняют световой поток, падающий на фотодиод. Фотодиод связан через следящую схему компенсации с напряжением на лампе. В результате на лампу подается такое напряжение, которое меняет яркость свечения лампы, чтобы световой поток, попадающий на светодиод, поддерживался в заданном диапазоне. По изменению напряжения на лампе регистрируется начало выпадения фибринового сгустка
Турбидиметрические коагулометры. Турбидиметрические
коагулометры регистрируют момент свертывания крови по приросту оптической плотности (рис. 2.15). При свертывании плазмы происходит резкое изменение светопропускания или рассеивания. В коагулометре
программируется, при каком приросте оптической плотности по отношению
144
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
к исходному уровню ( А) регистрируется момент свертывания. Время от внесения в оптическую кювету индуктора свертывания до момента достижения заданного А определяется как время свертывания плазмы в исследуемом тесте. Турбидиметрический принцип используется при определении показателей свертывания плазмы на многофункциональных фотометрах и биохимических анализаторах.
Рис. 2.15. Принцип регистрации момента образования сгустка турбидиметрическим коагулометром. При свертывании плазмы происходит резкое увеличение оптической плотности в фотометрической ячейке. Коагулометр определяет время от внесения активатора свертывания до момента изменения оптической плотности на А (например, на 0,1 ед. оптической плотности)
Нефелометрические коагулометры. Нефелометрические
коагулометры определяют момент образования сгустка по изменению рассеяния света. Разработки в этой области технологий используют принцип определения сгустка по боковому рассеянию света (рис. 2.16). Метод рассеяния обеспечивает высокое качество анализов – высокую специфичность и чувствительность детекции сгустка даже для сложной липемичной или иктеричной плазмы.
145
Рис. 2.16. Нефелометрический принцип измерения светорассеяния. Метод позволяет повысить точность измерений и воспроизводимость до 2-3%, а также снизить влияние на результат самого образца
Современные коагулометры сочетают в одном приборе несколько методов измерения, поэтому могут использоваться для комплексной оценки гемостаза.
Автоматизированный подсчет клеток крови. Автоматические счетчики крови оценивают размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики клеток. Они анализируют около 10000 клеток в одном образце и имеют несколько различных каналов подсчета клеточных популяций и концентрации гемоглобина. На основании количества определяемых параметров и степени сложности их условно разделяют на 3
основных класса:
I класс – автоматические гематологические анализаторы,
определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, а так же частичную дифференцировку лейкоцитов на три популяции – лимфоциты, моноциты и гранулоциты (3Dif).
II класс – высокотехнологичные гематологические анализаторы,
позволяющие проводить развернутый анализ крови, в том числе полную дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам-нейтрофилы, эозинофилы,
базофилы, моноциты и лимфоциты (5Dif), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему.
146
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
III класс – сложные аналитические системы, выполняющие не только развернутый анализ крови с дифференцировкой лейкоцитов, но и подсчет и анализ ретикулоцитов, некоторых субпопуляций лимфоцитов; при необходимости, комплектуются блоком для автоматического приготовления
иокраски мазков из заданных образцов крови.
Воснове работы анализаторов 1-го класса лежит кондуктометрический метод. Анализаторы 2 и 3-го классов используют в своей работе комбинации разных методов.
Кондуктометрические гематологические анализаторы. Технология
автоматического подсчета клеток основана на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал,
заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале возрастает.
Каждое событие – прохождение клетки через канал, сопровождается появлением электрического импульса. Концентрацию клеток определяют по числу электрических импульсов.
Разделение эритроцитов и тромбоцитов проводится по измерению амплитуды электрического сигнала: тромбоциты при прохождении измерительного канала генерируют электрические импульсы низкой амплитуды, эритроциты и лейкоциты – импульсы высокой амплитуды. После лизиса эритроцитов в суспензии остаются лейкоциты. Из первого счета импульсов высокой амплитуды вычитают импульсы высокой амплитуды второго счета (лейкоциты). Разница импульсов высокой амплитуды до и после лизиса соответствует количеству эритроцитов.
Разделение неизмененных лейкоцитов кондуктометрическим методом на основные субпопуляции невозможно в виду близости их объемов, однако подбирают такую композицию растворителя и гемолитика, что различные формы лейкоцитов претерпевают изменения размеров в разной степени и,
147
благодаря этому, могут разделяться. Изменение объема клетки зависит от многих факторов, включающих величину и форму ядра, объем цитоплазмы,
наличие внутриклеточных включений, поэтому размер трансформированных клеток не соответствует размерам клеток при визуальном просмотре их в мазке крови. После трансформации лейкоциты распределяются на гистограмме следующим образом (рис. 2.17):
Область малых объемов (35-90 фл) формируется лимфоцитами,
которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме.
Гранулоциты (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы) напротив,
подвергаются небольшому набуханию и расположены в области больших объемов (120-400 фл).
Между двумя пиками имеется зона так называемых «средних лейкоцитов» (90-120 фл), которая лучше всего коррелирует с моноцитами.
Однако в область средних клеток могут частично попадать базофилы,
эозинофилы, различные патологические формы.
Рис. 2.17. Схема гистограммы распределения лейкоцитов по объему при кондуктометрической дифференцировке. Между 1 и 2 дискриминаторами располагается зона лимфоцитов, между 2 и 3 – «средних» клеток, между 3 и 4 – гранулоцитов
Высокотехнологические гематологические анализаторы.
Высокотехнологические гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5-ти (5Diff)
основным популяциям, используя различные принципы дифференцирования
клеток: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты,
148
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
оценивать наличие незрелых гранулоцитов, анализировать ретикулоциты и их субпопуляции, проводить оценку стволовых гемопоэтических клеток и субпопуляций лимфоцитов. Многочисленные функции гематологических анализаторов стали возможны, благодаря развитию новых технологий. В
каждом случае в этой группе анализаторов применяется не менее 3 разных технологий, комбинированный результат которых дает возможность дифференцировать лейкоциты.
Технология VCS включает одновременный компьютерный анализ клеток по объему, электропроводности и дисперсии лазерного света.
Полученные по трем каналам данные с помощью электроники комбинируются и анализируются, в результате происходит распределение клеток по дифференцировочным кластерам и, таким образом, лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты,
нейтрофилы, эозинофилы и базофилы (рис. 2.18). Результатом отображения объемного графика на плоскости является лейкоцитарная скатерограмма, на которой каждый тип клеток имеет свою зону расположения.
Рис.2.18. VCS-куб, определяющий лейкоцитарную скатерограмму. Клеточные кластеры размещаются на цветной объемной диаграмме, где по оси Х – нормированная рассеивающая способность, по оси Y – объем клеток, по оси Z – структурная электропроводимость
149
Технология MAPSS – Multi Angle Polarized Scatter Separation –
мультипараметрическая система лазерного светорассеивания – регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами. Этот метод заключается в компьютерном анализе дисперсии лазерного счета клетками крови. Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких
еесвойствах, как:
размер клеток – для чего оценивается прохождение поляризованного лазерного луча под малым углом рассеивания,
структура и степень сложности клеток – оценивается по анализу
рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до
7о,
ядерно-цитоплазматическое соотношение - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до
10о,
оценка формы клеточного ядра – осуществляется благодаря анализу светорассеивания поляризованных лазерных лучей под углом 90о,
для оценки клеточной зернистости и дифференцировки эозинофилов
используется оценка светорассеивания деполяризованного луча под углом в
90о.
Принцип жидкостной цитохимии (измерение активности пероксидазы в лейкоцитах), в сочетании с методами кондуктометрии, гидродинамического фокусирования, оптической абсорбции, позволяет проводить дифференцировку лейкоцитов. Использование пероксидазной реакции основано на различной ее активности в лейкоцитах. Так, эозинофилы и нейтрофилы имеют интенсивную пероксидазную активность, моноциты – слабую, в лимфоцитах она не выявляется.
Проточная цитохимическая техника включает регистрацию рассеянного и поглощенного светового луча. В лейкоцитарном канале после
лизиса эритроцитов и стабилизации лейкоцитов происходит цитохимическая
150
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/