6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Клиническая_лабораторная_диагностика_Учебник_В_В_Долгова_2016
.pdfреакция, далее лейкоциты дифференцируются по двум признакам: размеру клеток, определяемому методом рассеивания лазерного луча, и
пероксидазной активности – по поглощению клеткой светового потока.
Дифференцировка базофилов от других гранулоцитов проводится в базо-
канале. Цитоплазма всех лейкоцитов за исключением базофилов подвергается лизису после обработки пробы специфическим лизатом.
Проточная цитофлюориметрия с использованием флуоресцентного красителя полиметина, который связывается с ДНК и РНК клеток, позволяет использовать его для дифференцировки лейкоцитов и для подсчета ретикулоцитов. Анализ клеток происходит в проточной кювете при пересечении луча лазера. После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеивание последнего под большим и малым углами и возбуждение флуоресцентного красителя.
Гематологические анализаторы с полным дифференцированным подсчетом лейкоцитов позволяют с высокой точностью дифференцировать лейкоциты, провести скрининг нормы и патологии, динамический контроль за лейкоцитарной формулой и резко сократить ручной подсчет лейкоцитарной формулы.
Проточная цитофлуориметрия. В основе проточной цитофлюориметрии лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.
Фотометрические каналы используются для оценки размеров клеток и внутриклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размерам, по-
разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. Если размер частиц меньше длины волны облучающего монохроматического света лазера
(например, внутриклеточные структуры), то существенное количество света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние). В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с размерами рассеивающихся частиц,
151
световая волна как бы огибает частицу, взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на небольшой угол – малоугловое светорассеяние. Такой тип рассеивания возникает при взаимодействии света с поверхностью клеток разного размера. При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния возможно выделить все клеточные популяции лейкоцитов. Флюоресцентный канал применяется для изучения клеточных маркеров, при этом используются моноклональные антитела
(МАТ) к мембранным и внутриклеточным компонентам, меченные различными флюорохромными красителями. При облучении клеток длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того, флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету.
Проточные цитофлюориметры могут быть оборудованы одним, двумя или более лазерами. В случае использования двух или более лазеров в исследования могут быть включены флюорохромы, возбуждаемые на разных длинах волн. Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат (FITC), который спускает свет,
улавливаемый в зеленой области спектра, фикоэритрин (РЕ) – красное свечение. При выборе сочетаний флюорохромов для одновременного определения нескольких клеточных маркеров следует учитывать способность оптической системы прибора разделять и одновременно регистрировать сигналы от используемых флюорохромов. Использование многоцветного проточноцитометрического исследования позволяет одновременно получить информацию о нескольких антигенах на поверхности клеток.
152
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
Проточная цитофлюориметрия – быстро развивающаяся технология в клинической лабораторной диагностике. Основными направлениями проточной цитометрии считаются количественная и функциональная характеристика клеток:
поверхностные антигены;
внутриклеточные цитоплазматические молекулы – цитокины,
бактерицидные белки, сигнальные молекулы, белки цитоскелета;
внутриклеточные ядерные молекулы (транскрипционные факторы,
ядерные белки, ДНК и ее фрагменты, РНК, хромосомы, мембранный потенциал митохондрий, концентрация ионов Са2+, активность ферментов;
оценка абсолютного числа CD4+ Т-лимфоцитов для оценки активности ВИЧ.
Проточная цитофлюориметрия играет ключевую роль в онкогематологии. Она используется с целью диагностики и мониторирования опухолевой популяции при острых лейкозах и лимфопролиферативных заболеваниях (ЛПЗ), прогноза, подсчета абсолютного количества стволовых гемопоэтических клеток, диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии.
Разработка гибридомной технологии получения моноклональных антител (МАТ) предоставила возможность изучить линейно-специфические,
дифференцировочные, активационные антигены клеток. МАТ со сходной специфичностью были объединены в группы (кластеры). Первоначальное значение понятия «кластер дифференцировки» (CD – сluster of differentiation)
подразумевал набор МАТ, распознающих одну и ту же антигенную структуру на поверхности клеток. Со временем термин «кластер дифференцировки» стал означать саму структуру на клеточной мембране,
отражающей фенотип клетки. Известно более 300 кластеров дифференцировки клеток человека и их число постоянно пополняется.
Проточная цитофлюориметрия позволяет исследовать антигены,
имеющие прогностическое значение. Широкое использование в клинической
153
практике моноклональных антител значительно улучшило результаты лечения больных лимфомами. Для успешного их применения необходимо до начала терапии исследовать степень экспрессии антигенов на соответствующих клетках-мишенях. Используя метод проточной цитофлюориметрии, в процессе лечения можно проводить мониторинг остаточной популяции опухолевых клеток. Широкое использование проточной цитофлюориметрии в онкогематологии привело к качественно новой диагностике лейкозов и лимфом, а также к разработке новых подходов
воценке эффективности лечения и мониторинга минимальной остаточной болезни, определяющей дальнейшую тактику ведения больных.
Электрофорез. Электрофорез – движение заряженных частиц в растворе под действием электрического поля. Электрофоретический метод в клинической лабораторной диагностике – это способ пространственного разделения молекул, имеющих разный заряд и размеры, путем помещения их
вэлектрическое поле. Электрофореграмма белков биологических жидкостей человека (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость) позволяет получить значительную диагностическую информацию. У здорового человека относительное содержание белковых фракций при определении их
всыворотке крови методом электрофореза на бумаге, следующее: альбумины
– 55-65%, α1-глобулины 3-6%, α2-глобулины 7-10%, β-глобулины – 7-12%, γ-
глобулины – 13-19%.
При многих заболеваниях наблюдается изменение соотношения фракций, тогда как общее количество белка обычно мало изменяется.
Выявление этих изменений с помощью метода электрофореза широко используется в диагностических целях.
Основными типами электрофореза являются: зональный электрофорез,
изотахофорез, изоэлектрическое фокусирование, иммуноэлектрофорез.
Зональный электрофорез ведется при постоянном (не изменяющемся)
значении рН буферного раствора, заполняющего данный носитель (бумагу,
гель, др.). Исследуемый образец наносится пятном или тонким слоем на
154
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
носитель, по которому и перемещается в электрическом поле. Усложненным вариантом зонального электрофореза является диск-электрофорез
(многофазный зональный электрофорез), при котором рН и другие характеристики, постоянные внутри одной «фазы», при переходе к другой
“фазе” скачкообразно изменяются.
При изоэлектрическом фокусировании в среде для электрофореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается в зоне, где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI). Для создания градиента рН обычно используют раствор полиамино-поликарбоновых кислот, которым насыщают носитель. В отсутствии электрического поля эта смесь обычно имеет рН=6,5. При наложении электрического поля указанные кислоты обеспечивают линейный градиент рН от 3 до 10.
При изотахофорезе заряженные ионы сначала разделяются в соответствии с величинами их заряда и подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с одинаковыми и постоянными скоростями.
Иммуноэлектрофорез сочетает в себе электрофоретическое разделение белков с иммунопреципитацией, основанной на реакции «антиген – антитело». Этот тип электрофореза превосходит остальные по чувствительности и разрешающей способности.
В электрофорезе важен тип носителя жидкой фазы. Преимущества и ограничения нескольких носителей, используемых в клинической биохимии представлены в табл. 2.3.
С помощью электрофореза возможно разделение не только белковых фракций, но также липопротеидов, изоферментов лактатдегидрогеназы,
щелочной фосфатазы, выделений фракции гликированного гемоглобина. Это достигается в новых разработках, в частности при использовании капиллярного электрофореза.
Капиллярный электрофорез основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (около 2 нл)
155
вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером – электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения
(до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей от заряда и массы и в разное время достигают зоны детектирования.
|
|
Таблица 2.3 |
Преимущества и ограничения носителей при электрофорезе |
||
|
|
|
Название метода |
Преимущества метода и/или |
Недостатки |
|
носителя |
|
На |
Сниженная конвекция, |
Непрозрачность. Загрязнения и |
фильтровальной |
разделенные зоны можно |
неоднородность бумаги мешают |
или |
зафиксировать и окрасить. |
разделению. «Хвосты» на |
хроматографичес- |
Простое оборудование |
электрофореграммах из-за высокой |
кой бумаге |
|
адсорбционной емкости. Фон |
|
|
окрашивается. |
На пленках из |
Быстрый, требует меньшего |
Непрозрачность в водных растворах |
ацетата целлюлозы |
количества пробы для анализа. |
(можно добиться прозрачности, |
|
Низкая адсорбционная |
погрузив в минеральное масло). |
|
емкость помогает избежать |
Дороже, чем при использовании |
|
появления “хвостов”. После |
бумаги. Мало пригоден для |
|
окрашивания фон остается |
препаративного электрофореза. |
|
бесцветным. Пригоден для |
|
|
иммуноэлектрофореза. |
|
В агаровом и |
Удовлетворительная |
Из-за отрицательного заряда на |
агарозном гелях |
прозрачность, высокая |
сульфатных и СООН-группах сетки |
|
пластичность (проще резать, |
агара возникает электроосмос, |
|
удобнее красить и определять |
приводящий к неравномерному |
|
ферментативную активность |
распределению электрического поля, а |
|
прямо в геле), простота |
иногда – гидростатического давления. |
|
изготовления. |
Возможно химическое взаимодействие |
|
|
веществ с агаром. |
В |
Химически инертен, можно |
На сегодняшний день наилучший |
полиакриламидном |
кипятить. Можно задать |
носитель, но готовится из акриламида - |
(ПААГ) геле |
необходимый размер пор и |
ядовитого вещества |
|
обеспечить свойства |
|
|
молекулярного сита. Высокая |
|
|
прозрачность. Легко готовить. |
|
|
Упругий, прочный. |
|
Хроматографические методы. Хроматография – физико-химический
метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их
156
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент),
протекающей через неподвижную. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества: если хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают однородным (без примесей). Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать и количественно определять
(массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-
химическими методами.
В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой,
различают следующие виды хроматографии – адсорбционную,
распределительную, ионообменную, эксклюзионную (молекулярно-ситовую).
Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью);
распределительная хроматография – на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе и элюенте; ионообменная хроматография - на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой
(ионитом) и компонентами разделяемой смеси; молекулярно-ситовая)
хроматография – на разной проницаемости молекул в неподвижную фазу
(высокопористый неионогенный гель). В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают:
газовую хроматографию ГХ (GC);
жидкостную хроматографию ВЭЖХ (HPLC).
Газовая хроматография применяется для газов разделения, определения примесей вредных веществ в воздухе, воде, определения состава продуктов основного органического синтеза, лекарственных препаратов.
Жидкостная хроматография используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов,
157
белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10-11-10-9 г), что исключительно важно в биологических исследованиях.
Микрочиповая технология. Биологические микрочипы - технология,
которая выполняется одновременно на большом количестве микрозон
(микроаррэев), в которые нанесены специфические антигены (белковый анализ) или праймеры нуклеиновых кислот (ДНК\РНК анализ). Микрочипы предназначены для выявления большого количества возможных вариантов биохимических, иммунохимических, молекулярно-биологических реакций.
Высокая производительность, относительно низкая стоимость анализа,
наряду с высокой чувствительностью и специфичностью определения,
делают это направление в клинической лабораторной диагностике наиболее перспективным. Благодаря высокой чувствительности, биочип-анализатор способен обнаруживать очень низкие концентрации аналитов. Можно говорить о регистрации отдельных молекул, если их плотность в микроаррэях составляет около 1 молекулы на квадратный микрон.
Конкурентные преимущества микропланшетных иммуночипов обусловлены тем, что их применение позволяет кардинально поднять производительность лабораторий. Кроме того, снижаются затраты на расходные реагенты, так как стоимость мультиплексных тестов в расчете на один выявляемый аналит значительно ниже. Микропланшетный формат технологии позволяет легко адаптировать ее для любой клинической лаборатории, так как не требуется иное дополнительное оборудование, кроме биочип-анализатора. Подготовка проб осуществляется также как и в иммуноферментном анализе с использованием обычного лабораторного оборудования для работы с микропланшетами (шейкеры, промыватели,
диспенсеры). Преимущества технологии иммуночипов очевидны, когда речь заходит о получении комплексной картины заболевания, формируемой с помощью лабораторных тестов, а также при анализе малых количеств
158
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/
тестируемого материала, например при скрининге новорожденных с использованием микрообразцов крови, высушенной на фильтровальной бумаге. Микрочиповые системы разрабатываются для осуществления биохимических, энзиматических, иммуноферментных реакций, реакций ДНК-гибридизации, полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Особый интерес подобные системы представляют для анализа молекул ДНК методом ПЦР для диагностики таких заболеваний как туберкулез, вирусный гепатит,
инфекций, передающихся половым путем, онкологических и генных заболеваний, а также для определения генома человека и идентификация личности. С открытием ДНК-микрочипирования стало легче диагностировать генетические заболевания. Речь идет о таких хромосомных болезнях, которые вызывают умственную отсталость у рожденного ребенка и другие пороки развития – как умственного, так и физического.
Культуральный метод. Культуральный метод является отличительной особенностью микробиологических (бактериологических) исследований.
Наличие культурального метода в клинической лаборатории дает основание для выделения бактериологического отделения. Главная составляющая культуральных методов – культивирование возбудителя на питательных средах, в организме лабораторных животных или на культурах тканей с целью выделения его в чистой культуре и последующей идентификации;
Задачи, решаемые культуральным методом:
этиологическая расшифровка инфекционного заболевания;
идентификация биологического вида бактерии-возбудителя;
идентификация и дифференциация вирулентных (патогенных)
вариантов возбудителя (C. diphtheriae, Cl. dificile, E. coli, Y. enterocolitica);
контроль эффективности лечения, контроль излеченности, контроль эрадикации инфекции (при туберкулезе, сифилисе, дифтерии, острых кишечных инфекциях, сальмонеллезах, брюшном тифе, инфекции,
вызванной H. pylori);
выявление и дифференциация суперинфекции, рецидива,
159
реинфекции (при туберкулезе, инфекции, вызванной H. pylori, других хронических инфекциях);
контроль антибиотикорезистентности (первичной, вторичной)
штаммов возбудителей бактериальных инфекций;
Рост инфекционного агента в культуре – единственный надежный показатель жизнеспособности патогена. Иммунохимические, молекулярно-
биологические, генетические подходы позволяют доказать наличие патогенна в биоматериале, но только культуральный метод доказывает его жизнеспособность. Методы, не позволяющие дифференцировать живые и
«убитые» микроорганизмы (ПЦР, РИФ), следует с осторожностью использовать при контроле излеченности. Подобные исследования необходимо проводить не ранее, чем через несколько недель после окончания этиотропной терапии, так как погибшие микробные клетки или их антигены могут длительное время сохраняться в организме и выявляться с помощью этих методов.
Успех выделения чистой культуры микроорганизма определяется правильностью выбора питательной среды и условий культивирования.
Универсальной питательной среды, использование которой гарантирует выделение любого микроорганизма, не существует. Обнаружение возбудителей в исследуемом материале, содержащем значительное количество сопутствующей микрофлоры (например, фекалиях), требует применения элективных питательных сред, предназначенных для выделения конкретных видов микроорганизмов. Для некоторых бактерий необходимы особые условия культивирования (микроаэрофильные – для кампилобактеров, анаэробные – для клостридий и бактероидов, атмосфера,
обогащенная углекислым газом – для нейссерий). Все это следует учитывать при направлении материала в лабораторию.
Методы экспресс-анализа. Методы экспресс-анализа получили распространение за счет разработки, производства и использования портативных аналитических устройств, свойства которых позволяют их
160
Рекомендовано к покупке и прочтению разделом по физиологии человека сайта https://meduniver.com/