Радиобиология / Моссэ И. Б., Морозик П. М. Генетические эффекты ионизирующей радиации

Согласно этой гипотезе, механизм действия радиопротекторов самой раз- личной химической природы сводится к стимулированию реакций, повыша-

ющих уровень циклических АМФ в клетке. Как известно, именно молекулы цАМФ являются регуляторами метаболических процессов. Гипотеза Ланген-

дорффов объясняет связь радиопротекторов с защитой от гибели облученных животных. Возможно, эти же процессы, нормализующие состояние облучен- ной клетки, могут играть роль и в защите от мутагенного действия облуче-

ния, например, благоприятствовать процессам репарации.

Существует представление о комплексном механизме действия аминотио- лов, согласно которому после введения в организм радиопротектора происхо- дит обратимое кратковременное ингибирование радиочувствительных биохи- мических процессов репликации ДНК, биосинтеза РНК и белка, а также про-

цессов окислительного фосфорилирования [587]. В основе этих явлений лежит способность аминотиолов образовывать адсорбционные тиоэфирные, амид-

ные и дисульфидные связи с ферментами, что приводит к ингибированию биохимических процессов и тем самым увеличивает возможность репарации.

Наряду с этим существует мнение, что радиопротекторы оказывают за-

щитное действие за счет мобилизации восстановительной системы клетки, поскольку объекты с хорошо скоординированной системой репарации ДНК (например, клетки Micrococus radiodurans) радиопротекторами не защищают- ся. Причем радиопротекторы оказываются тем эффективнее, чем сильнее осу-

ществляют релаксацию ДНК [588, 589].

В научной литературе нет единого мнения о механизмах радиозащитного действия протекторов. В разных работах излагаются различные точки зрения на принципы радиопротекторной активности серосодержащих соединений [590–594]. С одной стороны, утверждается, что цистеамин стабилизирует структуру ДНК за счет образования S-S-сшивок и предотвращает расхождение концов поврежденной цепи, что требует для осуществления акта защиты высокой концентрации протектора. С другой – цистамин угнетает синтез ДНК, что создает условия для ее наиболее полной репарации. Предлагают даже использо- вать способность химических веществ угнетать процессы синтеза ДНК в ка-

честве ориентировочного критерия для отбора новых радиопротекторов [591]. Все существующие радиопротекторы являются донорами электронов и поэтому критерием для отбора радиозащитных препаратов могут быть их до-

норно-акцепторные свойства [592].

Согласно одной точке зрения, цистеамин увеличивает доступность по-

вреждений к ферментам репарации за счет релаксации ДНК хроматина [593]. Совершенно противоположное мнение о влиянии цистеамина на релаксацию ДНК состоит в том, что цистеамин повышает конденсацию хромосом и сни- жает доступность ДНК действию нуклеаз, вследствие чего уменьшается вы-

ход ферментативных двунитевых разрывов [594].

На первый взгляд многие из общепринятых гипотез механизмов действия радиопротекторов противоречат друг другу, однако это не так. Все они отра-

240

жают разные стороны сложных физико-химических и биохимических явле-

ний, происходящих в облученной клетке при введении в нее радиопротектора. Мы прикасаемся с разных сторон к системе сложнейших механизмов и про- цессов, происходящих в клетке, и делаем противоречивые выводы, если не ви- дим целого. Разнообразные радиобиологические эффекты, выявленные раз-

личными авторами, могут быть взаимосвязаны и взаимозависимы. Например, показано, что мутация rad51, ответственная в клетках дрожжей за дефект-

ность репарационной системы, обусловливает и нарушение регуляции синтеза SH-групп [595]. Следовательно, содержание эндогенных тиолов в клетке каким-то образом связано с протеканием в ней репарационных процессов. К аналогич-

ному выводу пришли и другие исследователи. Так, отмечается, что тиолы, осуществляя свое защитное действие, связывают кислород, увеличивают со- держание SН-групп и вызывают неспецифическую реакцию («биохимический

шок»), при которой возрастает объем ферментативной репарации [596]. Радиопротекторы самой разной природы вызывают в организме одни и те

же биохимические изменения, поскольку действие протекторов опосредуется системой цАМФ [597]. Эти наблюдения позволили объединить различные ги- потезы механизмов радиозащитного действия в единый «каскадный меха- низм», состоящий из ряда ступеней. На первой ступени при введении радио- протектора происходит выброс в кровь комплекса биогенных аминов; на вто-

рой – под влиянием биогенных аминов активируется система цАМФ; на третьей – запускаются цАМФ-зависимые метаболические процессы, имеющие прямое отношение к радиочувствительности клетки [597].

Таким образом, гипотезы «биохимического шока» Бака [575], увеличения уровня цАМФ [585] и повышения уровня эндогенных биогенных аминов [598] взаимосвязаны.

Очевидно, процессы, рассмотренные в этих гипотезах, не являются непо-

средственными исполнителями радиозащитного действия, а лишь отражают происходящие в клетке изменения, необходимые для увеличения в ней коли-

чества защитных агентов, таких как аутоантимутагены, антиоксиданты и др., которые по своей химической природе могут быть свободными небелковыми тиолами, фенолами (в частности, меланином). Эти защитные агенты могут осуществлять свое действие на основе донорства водорода или электрона, де-

зактивации свободных радикалов, стабилизации структуры макромолекул и т. п. [580]. Такие процессы могут защищать от первичных повреждений как саму ДНК, так и репарационную систему клетки. Поскольку, согласно гипоте-

зе Бреслера [599], повреждения в клетке возникают не в результате того, что система репарации не справляется с полным объемом поражения, а из-за на-

рушения координации отдельных этапов репарационных процессов, то более эффективная работа этой системы при действии каких-либо факторов объяс- няется не «стимуляцией», а коррекцией ее деятельности. В свете этой гипоте-

зы защита системы восстановления от повреждающего действия облучения органически вписывается в общую картину физико-химических и биологиче-

ских реакций, происходящих под действием протектора в облученной клетке.

241

В некоторых работах встречаются высказывания, что радиопротекторы, защищающие организм от лучевой гибели, должны обладать способностью уменьшать и мутагенное действие облучения (причем вывод делается на осно- вании изучения лишь хромосомных аберраций в соматических клетках). Су- ществует мнение, что поскольку индукция хромосомных перестроек в клет-

ках тела отражает общую картину лучевого поражения организма и может служить биологическим «дозиметром», то механизмы физиологических и ге-

нетических повреждений едины и, следовательно, едиными должны быть и средства защиты от них.

Однако это далеко не так. Изменения, происходящие на уровне целого ор- ганизма, могут не оказывать влияния на хромосомы и ДНК (особенно поло-

вых клеток). Соответственно, и радиопротекторы, уменьшающие смертность облученных животных, могут не влиять на частоту индуцированных облуче-

нием мутаций. Более того, даже разные типы мутаций модифицируются поразному, особенно если сравнить точковые мутации, представляющие собой изменения на уровне ДНК, и хромосомные перестройки, связанные с повреж- дением белковых структур (см. п. 2.1). Возможность модификации мутацион-

ного процесса различна на разных этапах радиобиологических процессов, развивающихся в облученной клетке. Эти процессы разделяются на четыре стадии:

1)физическая – в клетке возникают возбужденные и ионизированные мо- лекулы, неравномерно распределенные в пространстве. Эти события проис-

ходят в первые 10–16–10–13 с;

2)физико-химическая длится 10–13–10–10 с и состоит из реакций, приводя-

щих к перераспределению возбужденными молекулами избыточной энергии. На этой стадии образуются ионы и радикалы;

3)химическая – ионы и радикалы взаимодействуют друг с другом и окру-

жающими молекулами, формируя различные структурные повреждения. Это могут быть разрушения нуклеотидов в молекуле ДНК, образование разрывов

вДНК и хроматине, изменение конформации исходных молекул и т. д. По раз-

ным данным [579], эта стадия может длится 10–6–10–3 с или от 10–14 с до долей минуты [600].

Модификация азотистых оснований в ДНК и образование сшивок проте- кают за время от долей секунды до долей минуты, регистрируются при облу-

чении клетки и могут быть причиной генных мутаций [601];

4)биохимическая – работа репарирующих систем клетки сводится к лик-

видации перечисленных последствий облучения за время от долей минуты до нескольких суток [600].

Отсюда возможны два пути модификации мутагенного действия облучения:

1)снижение первичного поражения генетического материала – физико-хи-

мический уровень;

2)влияние на процессы формирования мутаций путем воздействия на ре-

парационные системы в клетке – биохимический уровень.

242

Второй способ осуществляется легче, хотя бы потому, что четвертая ста-

дия длится гораздо дольше, чем три первые. Поэтому факторы, влияющие на репаративные процессы в клетке, способны модифицировать мутационный процесс и после облучения. Кроме того, очевидно, не обязательно проникно-

вение вещества в клетку [602, 603]. Однако воздействия на метаболизм клетки, в том числе и на восстановительные процессы, эффективно изменяют выход лишь хромосомных перестроек, а индукция точковых мутаций при этом поч- ти не модифицируется. Более радикальным является первый путь – экраниро-

вание ДНК или уменьшение числа первичных изменений ДНК. В этом случае модифицируется индукция всех типов повреждений, в том числе и точковых мутаций. Но осуществить этот процесс гораздо труднее. Для такой защиты протектор должен присутствовать в клетке во время облучения, т. е. быть вве- денным до облучения. Кроме того, должна быть достигнута достаточно высо-

кая концентрация протектора в непосредственной близости от защищаемых молекул. Необходимо также, чтобы потенциал ионизации или энергия воз- буждения молекул протектора были ниже, чем потенциал ионизации и энер- гия возбуждения молекул субстрата, или чтобы протектор обладал антиради-

кальной активностью. Причем защитный эффект химического соединения определяется не только фактором поглощения, но и дальнейшей судьбой по-

глощенной энергии.

Энергия, поглощенная молекулой, может реализоваться тремя путями: а) переходом в энергию химических процессов; б) высвечиванием (процессы люминесценции); в) превращением в тепловую энергию.

Для протектора наиболее желателен последний путь преобразования энергии.

Процессы, связанные с внутримолекулярной компенсацией потерянных электронов или с передачей неспаренного электрона от уникальной макромо- лекулы другому соединению-акцептору электронов, иногда называют физи-

ко-химической репарацией (в отличие от ферментативной репарации) [604], а химические вещества, защищающие облученные клетки по этому принци- пу, – «ловушками энергии». Таким путем можно защищать и саму репараци-

онную систему от разрушающего действия облучения.

5.8.2. Механизмы радиозащитного действия меланина

Биологическая роль фенолов в организме растений и животных, а также механизмы их биологического действия описаны во многих исследованиях [122, 548, 605, 606]. Рассмотрим те из них, которые могут объяснить способ-

ность меланина уменьшать мутагенное действие облучения.

Известно, что содержание фенольных соединений у горных растений выше, чем у растений, произрастающих в долине [607], и по сравнению с послед-

ними они обладают большей радиоустойчивостью [608, 609]. Например, при

243

облучении в дозе 6 кР семян пленчатого ярового ячменя из низменной и гор-

ной репродукции частота хромосомных аберраций у первых возросла в 10 раз, тогда как у вторых она оставалась на уровне контроля [609]. Это указывает на существование прямой связи между радиоустойчивостью и содержанием фе- нольных соединений в пределах одного и того же вида растений [608]. Высо-

кое содержание фенольных и токоферольных соединений у горных растений можно расценивать как ответную реакцию растительного организма на по-

стоянное воздействие космических лучей и высокой радиоактивности горных пород. У горных растений отмечено также повышенное содержание аскорби-

новой кислоты [610].

Была выдвинута и экспериментально проверена гипотеза о возможном участии аутоантимутагенной системы в регуляции темпов мутирования при- родных популяций [611, 612]. Очевидно, что фенолы и витамины в этой систе- ме взаимосвязаны: 1) практически во всех растительных источниках феноль- ные соединения содержатся наряду с аскорбиновой кислотой; 2) в тканях рас- тений, растительных продуктах и в модельных растворах они взаимозащища-

ют друг друга от окисления; 3) показан синергизм их биологических эффектов как в растительных, так и в животных тканях [613].

На участках, загрязненных радионуклидами 90Sr, в популяциях тысячелистника обнаружено увеличение числа интенсивно окрашенных форм [614]. Предполагается, что такие пигментированные формы более радиоустойчивы,

ипоэтому в условиях хронического облучения отбор идет в их пользу. Инте- ресно, что на этих же участках наблюдалось и повышенное количество пиг-

ментных мутаций у хлореллы [615].

Таким образом, можно сделать вывод, что фенольные соединения, и в частности меланин, созданы самой природой для защиты организма от облучения.

Основной отличительной чертой меланина является его полимерная структура, которая обеспечивает не только поглощение солнечного света в наиболее активной УФ области, но и улавливание, стабилизацию и обезвре- живание возникающих при этом свободных радикалов. Этот процесс проте- кает в коже животных и человека, где присутствие и новообразование мела- нина представляет собой защитную реакцию организма на действие солнеч-

ного излучения, особенно ультрафиолетовой его части. Сложная сетчатая структура молекул меланина делает их идеальными «молекулярными сита-

ми», в ячейках которых и застревают активные осколки молекул, радикалы

идругие продукты фотолиза [122].

При облучении смеси меланина и яичного альбумина установлено, что пигмент принимает электроны от облученного белка [616]. Адсорбционный спектр смеси этих веществ свидетельствует о том, что интенсивность (высота) сигнала определяется меланиновым пигментом, а его ширина – присутствием альбумина. После облучения наблюдалось уменьшение меланиновой части спектра, что свидетельствует о его переходе в восстановленное состояние за счет адсорбции электронов с облученного белка. Аналогичные данные полу-

чены при введении меланина растительного происхождения в неокрашенную кожуру семян белой горчицы. Было зарегистрировано появление характерно-

го сигнала ЭПР, который тоже уменьшался после облучения [617].

244

Ионизирующая радиация наряду с ультрафиолетовым излучением являет- ся причиной возникновения свободных радикалов, в том числе и в биологиче- ских системах. Способность меланина улавливать, стабилизировать и инакти- вировать возникающие при этом свободные радикалы является одним из ос-

новных механизмов его радиозащитного действия. Показано существование корреляции между содержанием меланина и концентрацией парамагнитных частиц в клетке и предположено, что защитные свойства меланина обусловле-

ны его полимерной структурой и способностью накапливать в полимерных ячейках большое количество неспаренных электронов – ПЦ [618].

После гамма-облучения в дозах 300–600 Гр образцов белой бараньей шер-

сти, а также белой шерсти с добавлением меланиновых гранул, выделенных из чернил осьминога, и коричневой шерсти наблюдалось соответствующее увели- чение количества ПЦ во всех вариантах опыта [619]. Увеличение дозы облуче-

ния от 600 до 1000 Гр не влияло на количество образования ПЦ. Через 30 мин после облучения количество свободных радикалов в белой шерсти увеличива-

лось в 12–15, а иногда в 40 раз; в белой шерсти с добавлением меланина – в 3–3,5 раза и в коричневой – в 1,2–2,2 раза. Авторы предполагают, что в мела- ниновых гранулах происходит захват и рекомбинация индуцированных иони-

зирующими излучениями радикалов и мигрирующих возбужденных состояний. Подробное исследование механизмов радиозащитного действия меланина проводилось на грибах [620]. Об участии меланиновых пигментов в радиоустойчивости исследованных грибов судили по существованию прямой кор-

реляционной зависимости этого признака от концентрации ПЦ меланина. Эта зависимость наблюдалась при сравнении таксономически различных темно-

пигментированных гифомицетов, штаммов С. cladosporioides и его цветных мутантов, радиоустойчивость и концентрация ПЦ которых уменьшались с уменьшением их пигментации, а также при сравнении радиоустойчивости конидий С. cladosporioides разного возраста с накоплением пигмента в кле-

точных стенках.

Исследовались также процессы пострадиационного восстановления у му- тантов грибов с разным содержанием пигмента. Показано, что характер и уро- вень пострадиационного восстановления мутантов были сходными [620]. Со- ответствующие кривые восстановления были идентичны между собой по ха-

рактеру, выходу кривой восстановления на плато и максимально достигнутому уровню выживаемости после одноразового и фракционированного облучения. Таким образом, конидии изученных штаммов грибов оказались в одинаковой мере способными к восстановлению от радиационных поражений, однако эти культуры существенно различались радиоустойчивостью и концентрацией ПЦ их меланиновых пигментов. Это обстоятельство служит подтверждением гипотезы электронно-акцепторного механизма защитного действия мелани-

нового пигмента [621, 622].

Согласно этой гипотезе, защитное действие меланина связывается с адсорб-

цией образовавшихся в клетке вторичных электронов, что сопровождается

245

уменьшением сигнала ЭПР, т. е. чем выше у пигмента способность к восста-

новлению, тем эффективнее защита от ионизирующих излучений.

Меланин является, в сущности, стабильным свободным радикалом, так как в ячейках его сетчатой структуры фиксированы и длительно сохраняются свободнорадикальные группировки [548]. Обладая свойствами стабильного свободного радикала, меланин способен вступать в реакции образования ком-

плекса с переносом заряда и играет при этом роль акцептора электронов. Именно эти свойства объясняют низкую чувствительность самого меланина к воздействию ионизирующей радиации [623–625]. Такие реакции могут слу-

жить механизмом защиты клеток от свободных радикалов, возникающих под действием излучения [626].

Показано, что меланин создает буферную систему для избыточной энер- гии клеток, распределяя ее малыми дозами. Квант энергии, попадая на моле-

кулу мишени, мигрирует по ней, а затем утилизируется молекулой меланина. Поскольку промежуточные метаболиты меланинового обмена благодаря свободнорадикальному состоянию могут окисляться и восстанавливаться, об-

разующиеся бесконечные молекулы меланина срабатывают как электроннообменный полимер, который, приняв на себя радиационный удар, распыляет его по всей молекуле, перераспределяя ее электронный заряд (одновременно этот полимер является и донором электронов для других систем).

Благодаря наличию гидроксильных групп и особенностям электронной структуры бензольного кольца фенолы имеют склонность к легкой отдаче электронов. Они могут легко и обратимо окисляться, отдавая электроны и ядра водорода и выступая тем самым в роли восстановителей, антиоксидантов. Фе- нольное соединение постепенно расходует свои электроны и протоны, превра-

щаясь в хинон и защищая от окисления соседнее вещество [548]. И только после того, как ресурсы фенола исчерпаны, начинается окисление соседних молекул.

Внескольких работах исследован механизм радиозащитного действия пиг-

ментов антоцианов [627, 628], которые можно считать аналогами меланинов

всилу того, что они образуются в растениях под действием УФ-излучения (своеобразный «загар» растений) и так же, как меланины, служат для защиты расти-

тельных клеток от облучения. Показано, что антоцианы могут существовать

вокисленной и восстановленной формах и выполнять функцию переносчиков водорода в окислительно-восстановительных реакциях, влияя на ход мутагенеза.

Втканях животных при гамма-облучении накапливаются вещества полифенольнохиноидной природы, которые способны восстанавливать цитохром С [629]. Причем такой способностью обладает как необлученный, так и гамма-облученный 3, 4-диокси-фенилаланин (ДОФА).

Интересно, что синтез меланина в клетке стимулируется цАМФ [630], а ведь именно аденил-циклазной системе, по гипотезе Лангендорффов [582], принадлежит ведущая роль в осуществлении радиозащитного действия хи-

мических веществ.

246

Глава 6

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ РАДИАЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ

6.1.Направленный мутагенез

Внастоящее время имеются данные, свидетельствующие о возникнове-

нии большого количества мутаций при облучении на гамма-поле, и данные

овысокой мутагенной эффективности радиоактивных изотопов, вводимых внутрь растений. Применение изотопов может приблизить нас к разрешению проблемы направленного мутагенеза, так как они могут вызывать разные типы мутаций в зависимости от соединения, в состав которого их вводят. Пока проблема направленного получения изменений определенных призна- ков или локусов хромосом еще не решена. Имеются данные о том, что излуче-

ния с высокой ЛПЭ вызывают появление большего количества эректоидных форм. Однако шведскими исследователями, изучавшими культуру ячменя, были получены сотни мутантов под воздействием разных факторов. При изу- чении их генетической природы, доказано, что одни и те же измененные при-

знаки возникают у ячменя при мутациях в разных локусах хромосом. При этом разные локусы реагируют на различные мутагены с неодинаковой часто-

той. Например, у ячменя выявлен 41-й ген, влияющий на признак развития воскового налета (мутанты eceriferum). Из шести наиболее часто мутирующих генов три (с, q, j) мутируют чаще под действием химических мутагенов,

алокус I – преимущественно под действием излучений с высокой ЛПЭ. Излу-

чения с малой ЛПЭ обладают наименьшим избирательным эффектом. Сейчас делаются попытки управлять изменениями отдельных локусов, ис-

пользуя явление неодновременного удвоения участков хромосом при их реду-

пликации. Пока же меньшая избирательность в действии излучений с малой ЛПЭ может оказаться в некоторых случаях более выгодной.

Возможно, что решению проблемы направленного получения мутаций по-

может также совместное применение излучений и химических мутагенов.

Всвязи с проблемой эффективности мутагенов, т. е. получения наиболь- шего количества хозяйственно-ценных мутаций, встает вопрос о том, что счи-

тать хозяйственно-ценным. Опыт использования мутантов в селекции показал, что ценны не только те мутанты, которые можно сразу использовать в каче- стве материала для создания сорта, поскольку они обладают новым хозяй-

ственно-ценным признаком, а по урожайности и другим свойствам не уступают исходному сорту, но и такие, которые, имея важный новый признак (устойчи-

вость к полеганию, болезням, раннеспелость), уступают в чем-то исходному

248

сорту. Такие мутанты с успехом используют для гибридизации. Среди ком-

мерческих радиационных сортов, имеющихся за рубежом, примерно третья часть получена гибридизацией мутантов с различными сортами.

Важно также учитывать, что любой полученный мутант – это не готовый сорт, и с ним необходимо провести дополнительную работу. Рекомендуется: 1) вести отбор в мутантной линии, поскольку одновременно с основной мута-

цией в обработанном мутагенами материале возникает много малых мутаций, часто вредных; 2) скрещивать мутант с исходным сортом и в F2 отбирать вновь растения с желаемым мутантным признаком. Этот прием дает возмож- ность выявить генетическую природу мутации – ее доминантность или рецес- сивность, плейотропность действия мутантного гена (влияние его на ряд при-

знаков) и избавиться также от нежелательных сопутствующих мутаций; 3) скрещивать мутант с другими сортами, так как новый мутантный ген мо- жет давать разный эффект в генотипической среде, т. е. в организмах с отлич- ной наследственной основой. Хорошие результаты дает скрещивание одно-

типных мутантов, приводящее иногда к усилению определенного признака, а также разных мутантов для получения форм, обладающих обоими ценными признаками (например, неполегаемостью и скороспелостью); 4) испытывать мутанты в разных экологических условиях, поскольку мутант – это организм, у которого может быть изменена норма реакции: например, мутантный ячмень Паллас, полученный в Швеции, дает наилучшие результаты в Ирландии. Ран- неспелый мутант еа8 в Южной Швеции созревает на восемь дней раньше дру-

гих сортов, а в Северной – на два дня позже.

Перспективно использование ионизирующей радиации для получения так называемых малых мутаций, которые удается уловить лишь при биометриче-

ской обработке признаков у отдельных семей: это мутации, повышающие урожайность и изменяющие другие количественные признаки. Многие иссле- дователи продемонстрировали, что обработка семян мутагенами (и излучени-

ем, и химическими) сильно повышает изменчивость по этим признакам. Необходимо также обратить внимание на стерильные формы, возника-

ющие очень часто при экспериментальном мутагенезе: формы с мужской сте-

рильностью получены у донника белого (ФРГ), одновременно со снижением содержания глюкозидов. Эти формы используют для получения гетерозисных линий.

Большое влияние на получаемые результаты оказывает исходный матери- ал. Сорта одной и той же культуры (гороха, пшеницы, ячменя, сои и др.) раз-

личаются как по радиочувствительности, так и по мутабильности. Генотип сорта влияет не только на количество, но и на качество возникающих мута- ций. Различную радиочувствительность культур и сортов необходимо учиты-

вать для подбора доз при облучении семян, черенков и т. д.

Очень важен вопрос о связи радиочувствительности и мутабильности. Выше указывалось, что разработаны приемы частичного снятия повреждающего эффекта излучений, которые, снижая количество перестроек хромосом

249