С.Дж.Перт

coli этот эффект наблюдается, а у стафилококковнет (215]. Чтооы избежать влияния коэффициента показателя преломле­

ния и осмотического давления на оптическую плотность, тонич­

нос·1ъ добавляемой жидкости и клеточной суспензии должна

быть одна и та же.

Существует предположение, что оптическая плотность про­

порциональна концентрации клеток независимо от числа клеток.

Однако относительно этой точки зрения нельзя сделать каких­

либо общих утверждений, хотя это, возможно, и справедливо в

должна изменять это отношение, поскольку с увеличением ско­

рости роста увеличивается и размер клеток. Было установлено, что в периодической культуре Klebsiella aerogenes это отноше­ ние падает на 8% при достижении культурой стационарной фазы [114]. Иногда, прежде чем измерять оптическую плотность,

необходимо добавлять в клеточную суспензию токсичные соединения. Для этой цели часто испоJ1ьзуется раствор форма­

лина ( l %). Обработка формалином предотвращает изменение

оптической плотности при изменении тоничности среды [l 97].

Следовательно, обработка формалином может, по-видимому, быть использована для стабилизации оптической плотности.

Предложен метод определения биомассы в эмульсии угле­

водородов, основанный на измерении мутности. Эмульсия

нефть - вода делается прозрачной при добавлении пропионовой

кислоты [200].

3.7.Подсчет клеток и органелл

3.7.1.Общая картина и общий подсчет

Биомассу можно определять двумя путями: l) подсчетом общего числа индивидуальных организмов или органелл (та­ ких, например, как ядра, присутствующие в образцах) с по­ мощью микроскопов или некоторых электронных приборов или 2) подсчетом жизнеспособных колоний, вырастающих из инди­

видуальных клеток. Недостаток метода подсчета состоит в том,

что если число клеток в пробе мало, то ошибка выборки неиз­

бежна. Преимуществом метода является его специфичность и

более высокая (по сравнению с другими методами) чувствитель­

ность (табл. 3).

Выборки из сосчитанного числа клеток подчиняются закону распределения Пуассона. Если п - число сосчитанных opra•

10% среднего значения. Более подробные сведения об ошибках

при методе счета клеток можно найти в работе Мейнелла и

Мейнелл [210].

Визуальные подсчеты имеют то преимущество, что наблю­

датель может различать виды организмов, которые надлежит

подсчитать, и другие типы частиц или организмов в среде.

Число животных клеток определяют подсчетом ядер, выделяю­ щихся из клеток при добавлении О, 1 М лимонной кислоты и окрашивании кристалвиолетом [235, 287, стр. 327].

Электронные приборы для счета, такие, как счетчик Коулте­

ра, удобны при большом числе измерений и уменьшают ошибку выборки, так как дают возможность просчитать большое число проб. При работе с клетками малых размеров, таких, как бак­

терии, следует соблюдать особые предосторожности, чтобы изба­

виться от помех, вносимых фоновым шумом [142].

J.7.2. Подсчет живых клеток

Наиболее важные методы, основанные на способности инди­

видуальных организмов к размножению и образованию колоний,

которые можно подсчитать, описаны Мейнеллом и Мейнелл [210]. Для подсчета живых клеток должны использоваться не

минимальные, а богатые среды, поскольку изолированные ин­

дивидуальные клетки более требовательны к питанию, среде, чем плотная популяция в целом. С помощью метода элективных

сред можно пересчитать организмы разных типов, которые при­

сутствуют в смеси.

Метод подсчета, основанный на разбавленИ,И и используемый

при бактериологическом анализе воды, состоит в учете не про­ росших разведений после высева суспензии организмов в ряд пробирок со средой. Преимущество данного метода состоит в

том, что он дает возможность определять малые концентрации

организмов ( < l клетка/мл). Однако поскольку размер пробы мал, то велика ошибка измерения. Вместо метода подсчета с

помощью разбавления используется метод фильтрации через мембранные фильтры и выращивание видимых колоний на

фильтре.

3.8. Методы окрашивания

Наиболее бесспорный метод определения числа живых и

мертвых клеток состоит в сравнении чи::ла колоний и общего числа клеток. В некоторых случаях мертвые и живые клетки

2 Зак. 737

могут быть дифференцированы с помощью окрашивания краси"

телями. Живые клетки млекопитающих непроницаемы для три­

панового синего, а мертвые клетки воспринимают эту окраску.

Для культур дрожжевых клеток аналогично используется эозин.

Красители, окрашивающие только живые клетки, называются

витальными красителями. Окрашенные клетки млекопитающих

в культуре с нейтральным красным используются как количе­

ственный тест для определения клеток, переживающих вирус"

ную атаку [99].

Продолжительность экспоненциального роста частично зави­

сит от начальной концентрации субстрата, лимитирующего tуест.

до тех пор, пока не поглощаются 92% субстрата, лимит,ирующе­ rо рост. Следовательно, период, когда недостаток источников

питания влияет на рост, ограничен лишь небольшой частью

Время

Рис. 6 Шесть фаз на кривой роста периодической культуры.

/-лаг-фаза; /l-фаза ускорения роста; //J-фаза экспоненциального роста; /V-фаза

замедления роста: V-стацнонарная фаза: V/-фаза отмирания.

последней генерации. Это поведение типично для простых перио­

дических культур и говорит о том, что для них характерен ре­

жим питания экстремального типа, т. е. рост при избытке суб­

страта внезапно сменяется rолоданием. Следовательно, периоды

роста при скоростях ниже максимальной недостаточно длинны

для того, чтобы организм мог приспособить свою структуру к

оптимальной для данной скорости роста. Это ограничение ТV!О­

жет быть отчасти преодолено с помощью специально разрабо­ танного ведения периодического культивирования (гл. 21), а

полностью снять его возможно только в хемостатной культуре.

Поведение нерастущей биомассы, которая представляет со­

бой стационарную фазу роста и фазу отмирания, описано в

гл. 18. Кажущееся замедление роста, стационарная фаза и фаза

отмирания могут наступить, если возникнут некоторые условия,

летальные для организмов. При этом наблюдаемая скорость

роста будет определяться разностью между действительной ско­

ростью роста и скоростью отмирания клеток (гл. 7).

4.3. Оценка роста по одной точке

Иногда длительность роста в периодических культурах

сравнивают не по кривым роста, а по одной-единственной точке

роста, определяя ее после некоторого произвольного промежутка

времени. Следует отметить, что разность результатов, соответ­

ствующих этой единственной точке, можно интерпретировать

несколькими способами. Эта разность может отражать разли­

чия в длительности лаг-периодов, максимальной удельной ско­ рости роста, максимальной плотности популяции, концентрации ингибирующих продуктов или скорости отмирания биомассы.

Следовательно, пока из других данных не станет ясно, какие

из этих возможностей следует исключить, оценку роста по од­

ной точке следует принимать как комбинацию всех этих эффек­

тов. Такая оценка не дает возможности вычислить какие-либо

параметры роста.

4.4. Математическая модель

простой периодической культуры

Если рост периодической культуры ограничен только лишь начальным количеством субстрата, то кривую роста можно

предсказать, исходя из параметров роста. В модели, впервые

предложенной Моно (216, стр. 123], мь1 имеем

щего рост субстрата соответственно. Подста~ляя значение µ и s

3 уравнение (4.1), получаем

Сгруппировав члены левой части уравнJния (4.5), получим

Обычные вариации кривой роста показаны на рис. 7. Если

~актериальную массу измеряют по мутности, то часто наступ­

лению стационарной фазы предшествует небольшое уменьше­ _ние- UТТТТТЧе-СRой-п..iютности -(р-йс: 7, АJ:-Этб-можёт -бь1ть -артефак­

том, вызванным изменением отношения биомассы к оптической

плотности. Другим отклонением от идеальной формы кривой

роста, представленным на рис. 7, Б, является более быстрое

увеличение числа организмов во время первого удвоения, что

может быть обусловлено синхронным делением популяции

одноклеточных организмов. Обычно деление становится полно­

стью асинхронным примерно после двух генераций. Третий ва­

риант (рис. 7, В), называемый дuауксuей, свидетельствует о

последовательном использовании субстратов. Классическим при­

мером такого случая служит использование сначала глюкозы,

потом лактозы у Escherichia coli. Перегиб на кривой роста или

даже уменьшение биомассы соответствует моменту, когда исчерпывается первый субстрат и индуцируется новая фермент­ ная система, атакующая второй субстрат. Изучение этого явле­ ния при определенных обстоятельствах позволяет внести неко­ торую ясность в механизмы синтеза белка.

4.6.Культура полного вытеснения (тубулярная культура)

4.6.1.Общие положения

Культура полного вытеснения моделирует периодическую

культуру в открытой системе (рис. 8, А). В идеале инокулят и

среда перемешиваются на входе в систему, затем культура без

перемешивания с постоянной скоростью течет через ферментер.

Таким образом, все элементы культуры должны были бы иметь

одно и то же «время удержания» в сосуде при прохождении

«удержания» культуры, или время «замещения>> (replacemeпt),

дается формулой tr = V/F. В культуре полного вытеснения

неизбежно происходит некоторое перемешивание; это вызвано градиентом скорости в любом сечении сосуда с наибольшим значением скорости в центре сосуда. Если при прохождении культуры вдоль ферментера происходит некоторое перемешива­

ние, то время удержания распределено около среднего значе­

ния tr по закону Гаусса (рис. 9).

4.6.2. Культура без возврата биомассы

Эта система представлена на рис. 8, А. Если начальная кон­

центрация лимитирующего рост субстрата S,x » Ks, то рост био­

массы в каждом малом элементе культуры (dv на рис. 8, А).

40 Глава 4

может быть представлен с помощью уравнения периодического

роста. При этом µ = µт, до тех пор пока не исчерпан лимити-

рующий субстрат, тогда

Рис. 8. Культура полного вытесиеиия (тубулярная, схематически).

А. Без возврата биомассы. Б. С возвратом биомассы F, F5 н аF8-скорости потока в раз•

личных точках; х-концентрацня биомассы; s-концt-нтрацня лимитирующего рост суб­ страта; У-объем культуры; dv-малый элемент объема культуры; С-устройство для

концентрирования биомассы.

оВремя

Рис. 9. Распределение времени удержания в почти идеальной культуре

полного вытеснения.

Аf-частнца первоначально впрыснутого малого объема материала, появляющаяся из

сосуда в каждый интервал времеин дt.