С.Дж.Перт

Aspergillus. Работа Ролэна была совершенной в том отношении,

что он определил пищевые потребности не только качественно,

но и количественно, выразив их в виде выхода биомассы (эко­ номического коэффициента). Этой количественной стороной

вопроса, к сожалению, пренебрегали во всех последующих ис­ следованиях пищевых потребностей микроорганизмов.

В 1870-х годах Кох ввел метод чистых культур, гарантиро­ вавший, что инокулят содержит только известные виды бакте­

рий.

Говоря о замечательных работах Пастера, проведенных им до 70-х годов прошлого столетия, необходимо отметить, что в распоряжении Пастера не было метода чистых культур, даю­

щих исследователю большие преимущества. Возможно, воспро­ изводимость результатов Пастера зависела от элекгивносги его культуральных сред, обеспечившей достаточное постоянство

микробной популяции. Работами Пастера и его ученика Ролэна

была установлена потребность в главных и второстепенных

компонентах среды (разд. 12.l) и в источниках энергии. По­

требность в сложных органических веществах, теперь называе­

мых «факторами роста», впервые была обнаружена Вильдье [345] в 1901 г., когда он открыл витамин В, или факторы «биос»,

необходимые для роста дрожжей.

В тридцатых годах с введением метода колб на качалках

Клювером и Перквином [ l 73] началось развитие более сложной

аппаратуры культивирования. Это дало возможность применять

лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно для глубинных культур аэробных грwбов, которые раньше вы­

ращивались только на поверхности твердых или жидких сред.

В поверхностных культурах окружение организма гегерогенно,

а в глубинных - гомогенно, поэтому проще для изучения и кон­

троля. Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов

сыграли значительную роль в развитии промышленного произ­

водства антибиотиков. Возрастающее технологическое значение

культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес

инженеров к этой области и привело в 40-50-х годах к созда­

нию ферментеров полного смешения с автоматической регуля­ цией условий среды. В настоящее время такое оборудование

играет центральную роль при изучении поведения культур

микроорганизмов и тканевых клеток.

До 1950 г. исследование кинетических закономерносrей куль­

туры занимало незначительное место. Слейгор [300] выдвинул

концепции о взаимосвязях различных параметров культуры.

Хиншельвуд [138] предложил ценные модели кинетики реакций

в живой клетке. Моно [216] в своей монографии, явившейся

значительной вехой в исследовании кинетики, показал, как

можно охарактеризовать рост бактерий с помощью экономиче-

скоrо коэффициента, удельной скорости роста и концентрации

лимитирующего рост субстрата. Из этого аналитического под­

хода в дальнейшем [217, 227] последовало развитие теории

непрерыщюго культивирования хемостатного типа. В настоящее

время хемостатная культура имеет существенное значение для

объяснения взаимоотношений между организмом и средой.

Примерно с 1950 г. отмечается быстрое развитие методов культивирования животных клеток, чему особенно способство­

вало появление монослойных и суспендированных культур, дис­

пергирование клеточных культур трипсином, а также выяснение

пищевых потребностей клеток. Культуры растительных клеток

в меньшей степени привлекали внимание исследователей, коли­

чественная оценка результатов их исследования кажется менее

надежной, чем в случае культур животных клеток.

Теория культивирования микроорганизмов развивалась

крайне медленно по сравнению с теоретическими основами фи­ зики, химии или экономики, каждая из которых благодаря огромному числу крупных исследователей уже до 1900 r. пере­ росла в самостоятельную область знаний.

Такое отставание в развитии теории культивирования объяс­

нялось отнюдь не тем, что реакция клеток на условия среды,

как мгновенная, так и длительная, представляла меньший ин­ терес. Изучение открытых систем, среди которых наиболее

важной является хемостат, открыло с 1950 г. новые горизонты

как для теоретического развития этих вопросов, так и для

экспериментальной проверки теории.

популяции. Параметр µ, обозначающий скорость роста единицы

метр аналогичен сложным процентам. Так, например, удельная

Рост, подчиняющийся этому закону, называется экспоненциаль­

ным, или логарифмическим ростом. Основным параметром ха­

рактеризующим скорость роста, служит удельная скорость

роста. Остальные параметры роста, которые рассматриваются

ниже, могут быть выражены через удельную скорость роста.

2.2.2. Время удвоения биомассы

Зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения (td) биомассы можно получить, подставив в уравне­

ние (2.5)

х=2х0 и

Тогда

(2.7)

2.2.3. Степень размножения

Степень размножения определяется отношением х/х0, которое равно eµt [см. уравнение (2.6)]. С другой стороны, если био­

масса претерпевает п удвоении или генераций, мы можем запи­

сать

(2.8)

В экспериментах по культивированию целесообразно использо­ вать засев, количество которого составляет 10% конечного

количества биомассы. Тогда п будет равно 3,32.

2.2.4. Обратное время удвоения

Поскольку число удвоений биомассы за время t будет равно t{fd, мы можем записать

Взяв логарифм по основанию 2 от обеих частей уравнения

(2.10), получим

(2.11)

Наклон графика (l/td) зависимости log х от времени и есть обратное время удвоения. Некоторые исследователи предпочи­ тают выражать скорость роста через l/td, а не через удельную

скорость роста. Однако µ кажется нам предпочтительнее, по­

скольку этот член входит в основное уравнение (2.2) роста. Об

удобстве этого показателя свидетельствует универсальность его

применения в теории непрерывного культивирования. Важно

четко представлять, какого из этих двух способов следует при­

держиваться.

2.3. Справедливость закона экспоиенциального роста

Закон постоянного экспоненциального роста выполняется, если условия окружающей среды и состав биомассы остаются

постоянными. Другими словами, если скорость роста не подчи­

няется этому закону, то не выполняются либо одно, либо оба

из вышеуказанных условий. Наличие экспоненциальной фазы

роста хорошо известно в случае бактериальных и дрожжевых

культур, но закон постоянного экспоненциального роста уни­

версален и для всех прокариотов и эукариотов при условии, что

указанные выше условия выполняются. Справедливость закона

применительно к простейшим продемонстрировал Филпс [238],

а применительно к животным клеткамБерч и Перт [21]. Перт и Каллоу [258] установили, кроме того, применимость экспо­

ненциального закона к культурам плесневых грибов в гомоген­

ной перемешиваемой культуре. Рост нитчатых грибов может отклоняться от экспоненциального, что может объясняться либо образованием шаровидных колоний, в которых биомасса рас­

предел.ена ие гомогенно в среде, либо тем обстоятельством, что

доставка кислорода становится лимитирующим фактором. Из­

менения в окружающей среде, пожалуй, чаще всего являются

основной причиной, из-за которой не удается поддерживать постоянным экспоненциальный рост. Это неизбежно происходит

в периодической культуре - раньше или позже. Вероятно, в

дальнейшем изменения в окружающей среде вызовут сооrвет­

ствующие изменения в составе биомассы. Как будет показано в гл. 24, уже из простой модели роста биомассы следует, что в

ответ на изменение условий соотношения различных компонен­

тов биомассы будут автоматически подстраиваться так, чтобы скорость роста была максимальна в данных условиях.

где Лх - увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве Лs. Более строго экономический коэффи­

циент определяется пре:П.елом, к которому стремится отношение

ЛХ/Лs при Лs-+ О, т. е.

Следует отметить, что если х и s - концентрации биомассы и

субстрата соответственно, то

Y=-dx/ds.

Знак «минус» вводится потому, что значения х и s изменяются

в разные стороны.

Важность экономического коэффициента состоит в том, что

он выражает количественные потребности организма в пище.

Экономический коэффициент был использован Ролэном [272]

для выражения пищевых потребностей грибов. Последующие

исследователи-микологи имели тенденцию использовать величи­

ну, обратную У, называя ее экономическим коэффициентом 1•

В 1942 г. Моно [216] впервые показал, что если внешние усло­

вия в бактериальной культуре поддерживаются постоянными, то экономический коэффициент тоже будет постоянной, количе­ ственно воспроизводимой величиной. Таким образом, если х0 и

1 В советской литературе термином «экономвческий коэффщиент» обо­

значают не 1/У, а У. - Прим. ред.

Когда биомасса достигает своего максимума Хт, концентрация лимитирующего субстрата равна приблизительно О (s ~ О), т. е.

мы можем записать

Следовательно, для лимитирующего субстрата график зави­

симости Хт от so должен быть прямой линией с тангенсом угла

наклона, равным У. На рис. 1 изображен пример применения

Сооержание холинхлорui!а, мк:г/.мJt,

Рис. 1. Влияние концентрации холина на рост культуры LS-клеток мыши.

Точками иа графике обозиачены средние значения. Вертикальные линии соответствуют

разбросу данных (20].

этого отношения для определения экономического коэффициента при культивировании животных (мышиных) клеток в среде с

холином.

2.5. Метаболический коэффициент

Скорость потребления субстрата культурой в данный момент

времени выражается отношением

где х - биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент, или удельная скорость метаболизма. В качестве

хорошо известных примеров можно привести q0 , и qглюк для

потребления кислорода и глюкозы соответственно. Метаболиче­

ский коэффициент аналогичен ферментативной активности. Если состав биомассы и окружающая среда постоянны, то и q дол­

жен быть величиной постоянной.

Уравнение (2.19) используется для определения потребностей

всубстрате, особенно в кислороде, при различных скоростях

роста.

В гл. 16 будет рассмотрено применение метаболического коэффициента для определения скорости образования продукта.

2.6. Влияние концентрации субстрата ка скорость роста

Существование фазы экспоненциального роста в периодиче­

ской культуре доказывает, что скорость роста может в довольно

широких пределах не зависеть от концентрации субстрата. Сле­ довательно, рост в этом случае характеризуется кинетикой нуле­

вого порядка. Можно предположить, что кинетика потребJiения

субстрата будет соответствовать кинетике ферментативной реакции. Тогда, если s - концентрация субстрата, а q - мета­ болический коэффициент, то

где Ks, называемая константой насыщения, эквивалентна кон­

Уравнение (2.21) часто называют отношением Моно, так как именно Моно в l 942 г. [216] эмпирически установил, что это

выражение хорошо соответствует зависимости скорости роста

бактерий от концентрации субстрата (рис. 2). Значение К., об­

ратно пропорционально сродству организма субстрату. Преобра­ зуя уравнение (2.21), получаем

(2.22)

т. е., построив график зависимости l/µ от 1/s, получим прямую

линию, которая пересекает ось абсцисс в точке -l/Ks, а ось