С.Дж.Перт
.pdf
Влияние температуры |
171 |
ние на сродство между субстратом и ферментом. Иллюстрацией
этому служит сам факт существования ферментов, чувствитель ных к температуре. У термофильных бактерий, среди которых
есть способные к росту при температурах выше 90 °С, имеются
белки, обладающие исключительной устойчивостью к темпера туре [41]. Но в случае психрофилов не обнаружено структурных
изменений, способных обусловить устойчивость к холоду 1•
13.4. Влияние температуры на пищевые потребности
Снижение температуры роста бактерии может привести к
большому увеличеиию (на 10-20%) |
экономического коэффи |
циента (выхода биомассы), рассчитанного по источнику угле
рода и энергии. У Кlebsiella aerogenes при увеличении темпе
ратуры экономический коэффициент в расчете на глюкозу
уменьшался, что было, по-видимому, обусловлено увеличением
энергетических затрат на поддержание [323]; энергия актива
ции поддерживающего метаболизма составляла при этом
9000 кал. Температура может оказывать влияние на путь пре вращений источников энергии и глюкозы. Например, у Lactobacillus brevis окисление глюкозы при 24 °С идет по пути гетеро ферментативного молочнокислого брожения, а при 37 °С для окисления глюкозы требуется фруктоза в качестве акцептора водорода (с образованием маннита) [751-
При определенной скорости роста экономический коэффи
циент, рассчитанный по магнию, калию и фосфатам, при умень шении температуры снижается, что объясняется увеличением
содержания в биомассе РНК. [315].
При изменении температуры может изменяться потребность в факторах роста. В качестве классического примера назовем
Yersina (Pasteurella) |
pestis, которой во время |
роста |
при |
37 °С |
требовалось больше |
различных аминокислот, |
чем |
при |
28 °С |
[137]. Резкое изменение температуры с 28 до 37°С во время
роста культуры У. pestis оказывало летальное действие; чтобы этого избежать, необходимо было менять температуру посте пенно (Перт, неопубликованные данные). Отсюда следует, что синтез ряда ферментов у У. pestis чувствителен к температуре. Для развития Escherichia coli при температуре 44 °С треб_)'ется
добавлять в среду глутаминовую кислоту и никотинамид
Saccharomyces cerevisiae для роста при 38 °С, но не при
нуждается в пантотеновой кислоте и хлористом натрии
1 В последнее время появились работы, авторы которых придерживаются мнения об адаптации белков психрофилов к низким температурам (Александ ров В. Я., Клетки, макромолекулы и температура, Л., Наука, 1975; Лях С. П., Адаптация микроорганизмов к низким температурам, М., Наука, Прим. перев.
172 |
Глава 13 |
13.5. Влияние температуры на образование продуктов
Влияние температуры на вторичный метаболизм и на сверх
синтез промежуточных продуктов обмена может отличаться от
влияния температуры на рост. Так, в хемостатной культуре Aspergillus nidulans, лимитированной глюкозой, скорость обра
зования меланина увеличивалась почти в два раза при измене
нии температуры культивирования с 23 до 37 °С, скоfость же роста оставалась при этом постоянной (0,05 ч-1 ) [283 . У Ashbya gossypii сверхсинтез рибофлавина наблюдался то.т1ько при температуре 28 °С, хотя рост был одинаково хорошим при ука занной температуре и при 37 °С. Неразмножающиеся клетки
А. gossypii, выросшие при 28 °С, обладали способностью к оди
наковому сверхсинтезу рибофлавина как при 28, так и при
37°С. Следовательно, рост при более низкой температуре ведет,
по-видимому, к нарушению нормальной регуляции синтеза фер
ментной системы, участвующей в образовании рибофлавина
[77]. Результаты, полученные при работе с периодической куль
турой [231], показывают, что температура, оптимальная для
синтеза пенициллина, ниже температуры, оптимальной для
роста этого гриба, однако, чтобы установить это более точно, необходимо :провести проверочные опыты в хемостатной куль
туре при стационарном состоянии.
13.6. Влияние температуры на состав биомассы
микроорганизмов
Изменение температур культивирования оказывает влияние на РНК, белок и липидный состав клеток бактерий и дрожжей
[151]. При одной и той же скорости роста содержание РНК в
бактериях или дрожжах при снижении температуры увеличи
вается в несколько раз. Общее содержание белка в дрожжах
при изменениях температуры может увеличиваться или умень
шаться в зависимости от природы лимитирующего субстрата.
В липидах дрожжей при снижении температуры повышается содержание ненасыщенных жирных кислот. При повышении температуры сверх оптимальной, обеспечивающей максималь
ную скорость роста клеток Е. coli, отмечали значительное уве
личение содержания пальмитиновой кислоты за счет ненасы
щенных гексадекеновой и октадекеновой кислот [203]. Вероят
но, при изменении температуры липиды мембранной структуры постоянно модифицируются так, чтобы сохранялась их функция.
Разрушение мембранной структуры под влиянием температуры,
возможно, приводит к утечке метаболитов и, следовательно, к
стимуляции их сверхсинтеза.
При изменении температуры происходят качественные и КО•
.личественные изменения антигенного состава бактерии. Напри-
Влияние температуры |
173 |
:мер, некоторые антигены У. pestis, необходимые для проявления
вирулентности, синтезируются во время роста при 37 °С, но не
при 28 °С [263]. Подобные наблюдения дают основание думать,
что поверхностные структуры бактерий изменяются при изме
нении температуры роста.
13.7. Механизмы температурного воздействия
Влияние температуры на рост биомассы и ее активность
объясняется, по-видимому, влиянием температуры на структуру
клеточных компонентов, особенно белков и липидов, темпера турные коэффициенты скоростей реакций, зависящих в свою
очередь от энергий активации этих реакций. Ответная реакция
на первичное воздействие включает, вероятно, много вторичных эффектов, связанных с механизмами регуляции метаболизма,
специфичностью ферментативных реакций, клеточной прони цаемостью и составом клетки. Вторичные эффекты в определен
ной степени могут нейтрализоваться особыми условиями окру
жающей среды.
Глава 14
ДЕЙСТВИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВОДОРОДА
14.1. Внеклеточное и внутриклеточное значение р Н
Влияние водородных ионов на биологическую активность
имеет отношение либо к концентрации водородных ионов [Н+],
либо к активности водородных ионов (ah). Эти два параметра
взаимнопропорциональны: ah = f [Н+], где f- коэффициент
активности, который может изменяться в зависимости от ионной силы или от других факторов. Стеклянные электроды регистри
руют изменение активности водородных ионов, при этом точно
выполняется соотношение рН = -log (ah) и вместо ah можно
подставить [Н+] только в том случае, если коэффициент актив
ности равен единице. В разбавленной среде f ~ l, но если среда
представляет собой концентрированный солевой раствор, то это
может быть далеко от истины. Когда рассматриваются свойства
клетки, активность водородных ионов является более сущест венным параметром, и действие водородных ионов принято вы
ражать через рН.
Плазматические мембраны трудно проницаемы для водород
ных и ~идроксильных ионов, поэтому внеклеточная и внутри клеточная концентрации водородных ионов не уравновешивают
ся между собой, и, следовательно, должен, по-видимому, суще
ствовать траисмембранный градиент концентрации водородных
ионов. В соответствии с химио-осмотической теорией Митчелла [214] этот градиент концентрации водорода совместно с элек
трическим потенциалом мембраны определяет «протонную дви жущую силу», которая управляет мембранными реакциями.
14.2. Регулирование рН культуры
Во многих исследованиях микробных культур осуществлялся
плохой контроль рН, и рН нельзя было отнести к постоянным
факторам. Для того чтобы избежать значительного сдвига рН,
следvе1 представлять, какие ограничения присущи имеющимся
методам регуляции. рН культуры регулируется либо рН-буфе
ром, либо балансом между образованием и потреблением кис лот, либо автоматическим добавлением кислоты или основа•
ния.
Действие концентрации ионов водорода |
175 |
Ограничение в применении рН буфера имеет две стороны: диапазон возможных значений рН и способности буфера к
поглощению и образованию водородных ионов, а также воз
можное физиологическое влияние буфера. Фосфатный буфер ис пользуется обычно для областей рН от 6 до 8. Для значений
рН < 6 использовался фталат, а для рН > 8- борат. Чтобы
избежать сдвигов буферной емкости, образование кислот или оснований следует ограничивать правильным подбором состава
среды. Избыток карбоната кальция - эффективный способ ней
трализации большого кислотообразования, однако часто этот
метод неудобен.
Образование кислот в культуре можно сбалансировать по
глощением анионов, таких, как нитрат и ацетат, которые заме
щаются гидроксильными ионами. Сбалансировать обр.азQвание
оснований можно поглощением катионов, таких, как ионы ам
мония, которые замещаются ионами водорода. Часто поглоще
ние иона аммония является единственным источником образо
вания кислот. Этого можно избежать, заменив аммоний мочеви
ной или глицином.
Ограничения вышеприведенных методов регуляции рН
можно преодолеть при помощи автоматического добавления
кислоты или основания в зависимости от показаний стеклян
ного электрода. Обычно добавляют соляную, или серную кис лоту и одно из оснований - гидроокись натрия, калия или ,,
аммония. Газообразному аммиаку следует отдавать предпочте-_
ние перед гидроокисью аммония, так как гидроокись аммония,
даже в концентрированном виде (0,880), может быть загряз нена бактериальными спорами. Для изучения действия рН на агаровых средах можно создать градиент рН в пластинке arapa. Для этого на скошенный слой питательного arapa с опре деленным значением рН наливают слой arapa с другим
рН (286].
14.3. Влияние рН на рост и метаболизм
Влияние рН на скорость бактериального роста показано на
рис. -50. В отличие от кривой температурного эффекта |
(рис. 48) |
|
эта кривая довольно симметрична. |
Максимальная |
скорость |
роста поддерживается в интервале от |
1 до 2 единиц рН, а пол• |
|
ная область роста - в интервале от 2 до 5 единиц рН. |
|
|
Значение рН культуры оказывает |
большое влияние на ко |
|
нечнь1е продукты анаэробного превращения источников угле
рода |
и энергии. В анаэробных условиях или |
при лимитации |
||
кислородом |
у Klebsiella |
aerogenes в качестве |
главного про |
|
дукта |
сбраживания сахара при рН 5 образуется |
2,3-бутиленrли |
||
коль, |
а при |
рН 7 вместо |
значительной части |
бутиленrликоJIЯ |
Действие концентрации ионов водорода |
177 |
области (рН 5), а оптимум рН для индукции дезаминаз - в , щелочной области (рН 8). Таким образом, метаболические
изменения способствуют регуляции рН среды, сдвигая его в сторону нейтральных значений. ЭтW! результаты усложняются .1
изменениями в скорости роста, сопровождавшими изменения рН. :.
Эта трудность может быть преодолена с помощью хемостата. ·-
Гэйл и Эпс [103] высказали предположение, что количество
ферментов регулируется таким образом, чтобы поддержать по
с:гоянную активность и компенсировать влияние рН среды.
рН среды благодаря своему действию на диссоциацию соеди
нений, обладающих кислотными и основными свойствами, мо жет оказывать влияние на ингибиторные или токсичные свой
ства этих соединений. Например,. т.оксичность слабых кислот,
\:'.таких, как уксусная, часто зависит от рН. Свободные кислоты
обладают более высокой растворимостью в липидах, чем иони
зированные формы. Следовательно, снижение рН должно спо
собствовать проникновению кислот в клетку.
Зависимость от рН для вторичного метаболизма может
отличаться от зависимости для роста и первичного метаболизма.
Это было показано для Aspergillus nidulans, у которого удель
ная скорость образования меланина остается приблизительно
постоянной в пределах значений рН от 3 до 7 и увеличивается
в двадцать раз при изменении рН от 7 до 7,9 [283J.
14.4. Действие рН на состав биомассы и морфологию
Антигенный состав Yersinia pesti,; изменяется при измене
нии рН культуры. Так называемый «антиген 4» образуется
только при значении рН ниже чем 6,9, а оптимум находится около 5,9 [263]. Значение рН в культурах вида Bacillus влияет на состав клеточной стенки. При лимитации роста фосфатом тейхуроновая кислота образуется в щелочной зоне рН, а при
рН < 6 в значительной степени заменяется тейхоевой кислотой.
Если же рост лимитируется ионами либо магния, либо суль
фата, либо аммония, то тейхуроновая кислота отсутствует,
а образуется тейхоевая кислота, причем с уменьшением рН
ниже 5,0 число групп аланина, связанных в полимеры, увеличи
вается [91].
Морфология гифов мицелиального плесневого гриба Penicillium chrysogenum, выращиваемого в перемешиваемой погру
женной культуре, зависит от рН [257]. При рН 6 образуются
длинные тонкие нити, а при увеличении рН до 7 гифы укорачи ваются, утолщаются и вакуолизируются. Эти результаты сви
детельствуют о том, что состав клеточной стенки плесневого
гриба изменяется в зависимости от рН и при высоких значениях рН стенки бывают более слабыми и легко разрываются.
178 |
Глава 14 |
В общем значение рН во время роста оказывает значитель
. ное влияние на природу клеточной поверхности или материал оболочки.
14.5. Молекулярные основы действия рН
Значение рН культуры оказывает воздействие на состав
среды и на характер поверхности микроорганизмов, оказывая
влияние на диссоциацию кислот и оснований. Это воздействие
на поверхность клеток должно оказывать влияние на такие
свойства поверхности, как прилипание к стеклу или металлу и флоккуляция биомассы. От значения рН зависит также степень
хелатирования ионов металлов.
Наличие плазматической мембраны может сделать внутрен
нее содержимое клетки до некоторой степени независимым от
рН среды, однако очевидно, что рН окружающей среды легко влияет на метаболизм. Равновесие между внешней и внутрен
ней концентрациями водородных ионов может быть достигнуто
с помощью наличия в среде слабой жирорастворимой кислоты,
такой, как динитрофенол, который может действовать как про
водник протона через плазматическую мембрану [214]. Для
некоторых бактерий эффект этот можно объяснить способно
стью липофильных кислот ингибировать рост [101]. Значение
рН может воздействовать на конформацию молекул, которая в
свою очередь в случае ферментов может влиять на значение
Кт [82].
Становится все более очевидным, главным образом в ре
зультате применения приборов автоматической регуляции рН и
хемостатной культуры, что свойства клеток могут глубоко из меняться в узкой области значений рН. Однако молекулярные
основы этого эффекта пока еще мало изучены.
Глава 15
ДЕЙСТВИЕ АКТИВНОСТИ ВОДЫ И ТОНИЧНОСТЬ СРЕДЫ
15.1. Введение
Вода в живых клетках несет четыре основные функции: 1) как химический реагент в клетке, она вступает в реакции
гидролиза и конденсации; 2) служит растворителем для клеточ
ного пула метаболитов, таких, например, как аминокислоты,
концентрация которых может иметь критическое значение в
метаболической регуляции; 3) играет механическую роль, под
держивая тургор клеток, обусловленный гидростатическим дав
лением, которое развивается в клетках; 4) играет структурную
роль, обеспечивая гидратацию белка и других клеточных ком
понентов. Последняя функция зависит от способности воды об
разовывать водородные связи с полярными группами. Хотя вода
является существенным фактором роста, высушивание биомас
сы не всегда приводит к летальному исходу.
Содержание воды в клетке выражается как осмотическое давление (атмосферы), тоничность (осмоли) среды, или актив
ность воды. В случае культур микроорганизмов или тканевых
клеток осмотическое давление имеет небольшое значение за
исключением того случая, когда нужно определить, выдержит
ли клетка данную разность давлений через плазматическую мембрану. Тоничность или активность воды более значимая
мера наличия воды.
Термин «ионная сила» широко используется в микробиологии длн выражения концентрации солей - почти всегда для указа
ния концентрации хлористого натрия, - но он редко исполь
зуется в физико-химическом смысле,. когда ионную силу опре
деляют с помощью следующего равенства:
( 15.1)
где т1, т2 и т. д. и z1, z2 и т. д.- моляльности и валентности
ионо,в в растворе соответственно. Ионная сила i есть «мера ин
тенсивности электрического поля, обусловленного ионами в
растворе» [107, стр. 510]. Это электрическое поле влияет на
активность как ионов, так и молекул, находящихся в растворе.
В разд. 15.10 суммировано это значение i.
180 |
Глава 15 |
15.2. Определение активности воды
Активность воды в растворе можно выражать давлением 1ю
дяноrо пара подобно тому, как активность в растворе газа, та
кого, как кислород, выражается эквивалентным давлением
газа. Однако установлено, что более удобно соотносить актив ность воды в растворе (aw) с активностью чистой воды. В соот
ветствии с этим активность воды в растворе выражается отно
шением давления водяного пара раствора (р,) к давлению чистой воды (Pw) при той же температуре:
(15.2)
Отсюда следует, что aw эквивалентна относительной влажности
атмосферы в равновесии с раствором.
15.3. Взаимосвязь между активностью воды
иконцентрацией растuоренноrо вещества
Всоответствии с законом Роульта для растворов некоторого
идеального неэлектролита относительное уменьшение давления
пара растворителя равно молярной доле растворенного веще-
ства, т. е.
(Pw - дв)/.Рw.= n/(n + N), |
(15.3) |
где п - моли растворенного вещества, а N - |
моли воды в рас |
творе. Из уравнения (15.2) и (15.3) следует |
|
aw = 1 - п/(п + N) |
(15.4) |
пли |
|
aw = N/(n + N). |
(15.5) |
Если растворенное вещество - электролит, то вместо п подстав
ляем vn, где v- число ионов на молекулу. Если растворенное
вещество ведет себя не как идеальное, то истинное число частиц
растворенного вещества будет Фvп, где ф- осмотический коэф
фициент (разд. 15.4).
15.4.Взаимосвязь между активностью воды
иосмотическим давлением
Всоответствии с законом Вант-Гоффа уравнение для осмоти
ческого давления л раствора некоторого идеального неэлектро
лита будет иметь следующий вид:
лV = nRT, |
(15.6) |
где V - объем раствора, п - число молей растворенного веще
ства, R- газовая постоянная и Т - абсолютная температура.