С.Дж.Перт

Глава 9

ПОТРЕБНОСТЬ В КИСЛОРОДЕ И ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИМ

9.1. Введе-ние

Изучение потребности микроорганизмов в кислороде нача­

лось с открытия Пастером использования кислорода дрожжами для окисленшя источников углерода и энергии. Количественное

исследование этого вопроса не приносило никаких результатов

вплоть до 20-х годов, когда впервые появилось манометрическое оборудование для изучения интенсивности дыхания и стехио­ метрии окисления субстрата; манометрический метод, однако,

пригоден только для неразмножающихся, «покоящихся» клеток.

В 30-х годах для изучения дыхания был использован поляро­

графический метод с кислородным электродом [18], но прошло

еще несколько десятилетий, прежде чем кислородный электрод был усовершенствован и нашел широкое применение в изучении влияния киелорода на микроорганизмы. Также в 30-х годах

внимание исследователей привлек окислительно-восстановитель­

ный потенциал как фактор, способный играть регулирующую

роль в процессах окисления источников энергии, однако его

истинное значение для культуры микрооргаыизма все еще

остается неясным. Новые представления о роли окислительно­

воостановительного потенциала в культурах рассматриваются

в разд. 9.5.

Начиная с 40-х годов проблема обеспечения культур кисло­

родом при глубинном выращивании с высокой концентрацией

биомассы приобрела важное значение главным образом из-за

практической необходимости получения антибиотиков в про­ мышл-енном масштабе. Аналогичная проблема в производстве

пекарских дрожжей была решена эмпирически применением

«долинного метода». В сущности с помощью этого метода мож­ но регулировать потребность культуры в кислороде. В настоя­ щее время осущестзляется автоматический контроль концентра­ ции растворенного кислорода в глубинных культурах, и метод

этот имеет важное значение для выяснения потребностей в

кислороде, особенно при стационарном состоянии хемостатных

культур.

9.2. Потребность в кислороде

При аэробном метаболизме кислород выполняет роль акцеп­

тора электронов или водорода. Этот процесс совершается при

участии фермента оксидазы. Помимо выполнения роли акцеп­

тора электронов, кислород может - с помощью оксигеназ -

встраиваться в молекулу углеродных субстратов при их ката­ болизме. По имеющимся данным, оксигеназы участвуют в ка­ таболизме углеводородов и ароматических циклических соедU::-~ нений.

Количественно оценить суммарную потребность в кислороде для энергетического метаболизма можно по стехиометрии окис­

ления. Например, для окисления глюкозы в процессе роста

Escherichia coli записываем: С6Н12О6 + 602-+ 6C(k +6Н2О. Ко­

личество окисленного источника углерода считают равным тому

количеству, которое требуется для обеспечения энергетических

затрат, и, исходя из этого количества, определяют экономиче­

ский коэффициент (УЕ) при росте на данном энергетическом субстрате (разд. 8.2).

Когда в качестве источников углерода используют углево­

дороды, кислород расходуется не только на процессы образова­

ния энергии, но и на повышение уровня окисленности субстрата

до уровня биомассы. Из расчета кисло-родного баланса следует, что при использовании в качестве субстрата углеводородов на образование биомассы расходуется гораздо больше кислорода,

чем при выращивании микроорганизмов на углеводах [64]. Не­

обходимое при этом количество кислорода может быть рассчи­

тано следующим образом [158]. Примем, что А - количество

граммах сухой биомассы, образовавшейся на 1 г субстрата (г/r),

массы

или

алкана, количество кислорода, требуемое для роста на алка­

нах, оказывается в 3,6 раза больше, чем для роста на глюкозе.

Сравнение значений экономических коэффициентов, определен­

ных по количеству использованного кислорода, приведено в

табл. 5. Из сказанного выше следует, что если скорость транс­ порта кислорода (разд. 9.6.1) ограничивает производительность

ферментера, то максимальная производительность при исполь­ зовании в качестве субстрата глюкозы будет в 3,6 раза выше,

чем на среде с н-алканами.

Теоретически максимальное значение экономического коэф­ фициента по кислороду, когда в качестве источника углерода

используется глюкоза, можно подсчитать следующим образом. Допустим, что при окислении глюкозы 2 молекулы АТФ обра­

зуются за счет использования одного атома кислорода, т. е.

Р/0 = 2, и 2 молекулы АТФ образуются в процессе гликолиза,

тогда общее количество образующегося АТФ составит 26 моль на 1 моль окисленной глюкозы. Приняв, что УАТФ= 25 г сухой биомассы/моль АТФ (разд. 8.5), рассчитаем теоретически мак­ симальный экономический коэффициент по кислороду (Ух10), который будет равен 3,39 г сухой биомассы/г кислорода. Экспе­ риментальное значение Ух/О для бактерий и грибов, использую­ щих в качестве источника энергии углеводы, обычно близко к единице. Большая разница между теоретически раосчитанной и полученной экспериментально величинами Ух10 приписывается

энергетическим затратам на поддержание и пониженному обра­

зованию АТФ.

Вокислительных реакциях, протекающих с участием как

оксигеназ, так и оксидаз, между ними возможна конкуренция

за кислород. Активность этих двух ферментов можно опреде­

лить раздельно, если известна стехиометрия оксигеназной

реакции. Так, было высказано предположение [123], что при

окислении декана видами Pseudomonas скорость потребления

кис.rюрода в энергодающем процессе (q8,) выражается уравне.

нием

где q~,- общий метаболический коэффициент для кислорода и

qдеиан - коэффициент потребления декана; при расчетах эти коэффиценты выражают обычно в молях. При этом предпола­

гается, что декан и кислород включаются в оксигеназную реак­

цию в эквимолярных количествах. Следовательно, qдеиан будет равным скорости потребления кислорода в оксигеназной

реакции.

Активность кислорода в насыщенном растворе определяется

выражением а = fс,, где f - коэффициент активности. Актив­

ность газа можно выразить через его парциальное давление,

допуская а= pg. Тогда константа Генри (Н) становится обрат­ но пропорциональна коэффициенту активности. Наличие в

растворе солей обычно приводит к уменьшению растворимости кислорода, а следовательно, к повышению активности. Этот

эффект может быть весьма значительным. Например, в насы­

щенном растворе хлористого натрия растворимость кислорода

уменьшается примерно в два раза, а это значит, что коэффи­

циент активности удваивается. Зависимость растворимости

кислорода от степени солености морской воды иссJ1едовали

Трусдейл и др. [331].

9.4. Измерение количества растворенного кислорода

9.4.1. Определение концентрации

растворенного кислорода

Существуют два главных метода определения концентрации

растворенного кислорода. Один из них - титрование, осуще­

ствляемое обычно методом Винклера (цит. по [191]), в основе

которого лежит окисление закиси марганца кислородом в окись

и последующее титрование иода, освобождаемого при этом из иодистого калия. Этот метод дает большие погрешности при

наличии в растворе органических веществ, и, следовательно,

при исследовании сред для культивирования его применение

весьма ограничено. Второй метод основан на газометрии [282].

При использовании данного метода кислород выводится из

раствора в результате образования СО2, который и анализи­

руется. При работе этот метод в отличие от первого не зависит

от наличия в анализируемой жидкости органических веществ. Однако оба эти метода требуют слишком много времени и не обладают достаточной чувствительностью, чтобы использовать­ ся при диапазоне тех концентраций кислорода, которые обычно

лимитируют скорость дыхания микроорганизмов.

9.4.2. Измерение напряжения растворенного кислорода

г

Напряжение кислорода измеряют электрометрически с по­

мощью кислородного электрода; через электрод проходит ток,

сила которого прямо пропорциональна напряжению кислорода.

Следовательно, с помощью кислородного электрода можно из­

мерять активность кислорода в растворе, а не его концентра­

цию. Это, в частности, можно продемонстрировать на примере

насыщения воды хлористым натрием: концентрация кислорода

уменьшается наполовину, не оказывая при этом никакого влия­

ния на показания кислородного электрода при данном давлении

газа. Перевод показаний кислородного электрода в концентра­

цию кислорода дает представление о веJrичине Н. Однако в боль­ шинстве случаев показания электрода удобно выражать через напряжение растворенного кислорода. Кислородный электрод

можно с успехом использовать для измерения и регистрации на­

пряжения растворенного кислорода вплоть до долей миллиметра ртутного столба [196].

Для определения напряжения растворенного кислорода ис­

пользуется также следующий метод. В исследуемую культуру

погружают трубку из проницаемого для кислорода материала,

такого, как тефлон; затем трубка продувается азотом или каким­ либо другим газом, не содержащим кислорода. Поскольку рас­ творенный кислород диффундирует в трубку, то, измерив с по­

мощью какого-либо газового анализатора количество кислорода

в потоке газа, полученное значение можно перевести в напря­

жение кислорода.

9.5. Окислительно-восстановительный потенциал

9.5.1. Определение

Окислительно-восстановительный потенциал характеризует

способиость раствора отдавать или принимать электроны. Окис­

лительно-восстановительный потенциал измеряют, погружая инертный электрод, обычно из платины, в раствор, и регистри­

руя разницу в показаниях между платиновым электродом и

электродом сравнения.

Обратимый окислительно-восстановительный процесс можно

выразить в виде следующего равенства:

а (окислитель)+ ьн+ + пе +± с (восстановитель),

где а и с - число молей окислителя и восстановителя соответ­ ственно и п - число переносимых электронов. Окислительно­

восстановительный потенциал (Eh) процесса определяется из

где квадрат,ные скобки означают концентрации активных реа­ гентов (когда коэффициент активности равен единице, концен­

трации можно заменять активностями), R - газовая постоянная

и F - количество электричества (фарадей). Реакция водород•

ного электрода имеет следующий вид:

2Н+ + 2е ·~ Н2,

Стандартный водородный электрод получают при [Н+] = 1,0 М

и Рн, = l атм. Тогда Eh = Ео, потенциал которого принят за О.

Если потенциал измеряют не против стандартного водородного электрода, а против каломельного или какого-либо другого электрода сравнения, тогда, если Ei - измеряемый потенциал,

Е~- потенциал электрода сравнения, то Eh=E1 +Е~. ЗначенияЕ;;

для различных электродов сравнения приведены в работе Якоба

[156, стр. 101].

Из выражения (9.4) следует, что Eh зависит от рН. Выразим

уравнение (9.4) в иной форме:

Наклон кривой на графике зависимости Eh от значений рН,

когда активности окислителя и восстановителя постоянны, дол­

жен быть -2,30-bRT/nF, что соответствует изменению Eh при

изменении значения рН на l единицу. Если Ь/п = l, то отноше­ ние ЛЕh/ЛрН равно 58 мВ при 30°С.

Электрометрические измерения Eh детально рассматривают­

ся в работе Якоба [156]. Результаты измерения величины Eh

в большой степени зависят от подготовки платинового элек­

трода, особенно от степени его полировки [156, стр. 100].

В этом же исследовании [156] приводятся индикаторы, ко­

торые можно использовать для измерения Eh. Диапазон значе­ ний Eh индикатора можно рассмотреть на примере с метилено­

вой синью, для которой

мв+ + н+ + 2е ~ мвн

То же уравнение, но выраженное в милливольтах будет иметь

При рН 7 Еь = ЕЬ = Е0 - 203 мВ. Диапазон изменения индика­

тора должен соответствовать той области значений Eh, в кото­

рой количество индикатора в окисленной форме изменяется от