С.Дж.Перт
.pdfМетоды аэрации и перемешивания |
131 |
кислорода через неподвижную поверхность при окислении суль
фита в присутствии ионов меди. Следовательно, максимальная
скорость растворения кислорода |
(KLacs) в пробирках диамет |
|||||
ром 16 мм будет составлять 0,036 ммот,./ч или |
3,6 ммоль/л · ч, |
|||||
если в пробирке находится 10 мл жидкости и |
с.= 0,25 мМ; |
|||||
экспериментально |
найденное значение |
равно |
1,8 |
ммоль/л •Ч |
||
[301], т. е. |
имеет тот же порядок. |
При |
таком низком |
значении |
||
KLa (около |
10 ч-1 ) |
в неподвижной культуре в пробирках совер |
||||
шенно очевидно, что быстро наступает лимит по кислороду.
Диффузия кислорода в пробирку через ва"'ную пробку, как по
казано выше (разд. 10.14.5), едва ли ограничивает снабжение
кислородом культуры в пробирке.
Глава 11
ВЛИЯНИЕ КИСЛОРОДА
НА КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
11.1. Введение
Изучение действия кислорода на культуры микроорганизмов
началось с открытия Пастера, что дрожжи получают энергию
для роста или в результате окисления ими сахара кислородом
воздуха, или же в результате анаэробного расщепления сахара до этилового спирта и двуокиси углерода. Кислород ингибирует анаэробный процесс и одновременно снижает скорость расщеп ления глюкозы. Это ингибирующее действие кислорода, извест
ное теперь как эффект Пастера, может служить примером ре
гуляции метаболизма субстратом; однако механизм эффекта
Пастера до сих пор не изучен.
Вопрос о том, каковы потребности микроорганизма в кисло
роде для роста и реализации других функций, рассматривается
вразд. 9.2; настоящая глава затрагивает проблему ответной
реакции микроорганизмов на различное напряжение растворен
ного кислорода.
11.2.Лимитация роста кислородом
Впериодической культуре с постоянной величиной KLa,
когда рост лимитирован кислородом, скорость образования био
массы (dx/dt) становится постоянной и удельная скорость роста
уменьшается. Для изучения влияния лимитации роста кислоро
дом лучше всего использовать хемостатную культуру в стацио
нарном состоянии, при котором изменения удельной скорости
роста можно исключить. Влияние лимитации кислородом на
концентрацию биомассы в хемостатной культуре возможно
предсказать, исходя из уравнения (9.20). Подставим в это вы
ражение С8 = Hpg, с= Нр,, q0 , = D/Y0 , где Уовыход биомассы
в расчете на единицу кислорода, и dc/dt = О для стационарного
состояния; тогда концентрация биомассы будет равна
i=Yu( К~а + 1)(с5-ё). |
(11.1) |
Во многих системах KLa/D» 1, тогда уравнение |
(11.1) упро |
щается: |
|
(11.2)
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов |
135 |
Влияние повышенных давлений кислорода, когда это давле· ние выше 0,21 атм, или 159 мм рт. ст., на скорость дыхания
было исследовано на псевдомонадах, растущих на метаноле
[ 195]. Результаты указанной работы представлены на рис. 41, Б;
они показывают, что при парциальном давлении растворенного
кислорода от 30 до ~ 400 мм рт. ст. скорость дыхания сохра няется постоянной, но приблизительно с 500 мм рт. ст. q01
начинает колебаться, свидетельствуя о нестабильности метабо лической регуляции. Выше 560 мм рт. ст. q01 невероятно возра
стает с увеличением напряжения растворенного кислорода.
Ма,ксимальный выход биомассы Ух/о был обнаружен при на пряжении растворенного кислорода ниже 100 мм рт. ст., а при напряжении растворенного кислорода выше 100 мм рт. ст. и особенно когда его значение превышало 560 мм рт. ст., увели
чивались энергетические затраты на поддержание, что может
быть связано с необходимостью преодолеть токсичность кисло
рода. Макленнан и др. [ 195] пришли к выводу о том, что во
время изменения во всем диапазоне напряжения растворенного
кислорода происходит постояниая смена механизмов в клетке,
что можно было бы упустить при ограниченном изучении
влияния кислорода - только в его присутствии или в отсут
ствие.
11.4. Влияние условий роста на скорость дыхания
покоящихся клеток
Скорость дыхания покоящихся, т. е. неразмножающихся,
клеток является ценным показателем метаболизма. В какой
степени условия роста способны влиять на скорость дыхания
покоящихся клеток, этому пока еще не уделялось достаточного
внимания, однако ясно, что это влияние может быть значи
тельным. Изменение и распад ферментных систем происходят, по всей видимости, сразу, как только прекращается рост [96], и, чтобы уменьшить эти изменения, клет.ки необходимо перено
сить как можно быстрее из культуры в аппарат для измерения
дыхания. Скорость дыхания бактериальных клеток, лимитиро ванных углеродом, больше, чем у клеток, лимитированных
азотом [317]. Из результатов различных исследователей [121, 316] следует, что q02 покоящихся клеток увеличивается со ско-
ростью роста культур, из которых эти клетки были взяты. По
добные результаты дают основание думать о наличии постоян
ной регуляции скоростью роста содержания катаболических и
дыхательных ферментов.
Величина q0 , покоящихся клеток ба•ктерий может сильно
зависеть от напряжения растворенного кислорода во время
~ 136 |
Глава 11 |
роста. Максимальное |
значение q02 для клеток Escheгichia coli |
было получено, если культура росла в условиях лимита по кис лороду, но для Klebsiella aerogenes парадоксальным образом
м<Jксимальная величина q02 найдена, когда клетки росли в
анаэробных условиях [ 121].
11.5. Влияние напряжения растворенного кислорода
на содержание дыхательных и катаболических ферментов
вклетках
В· клетках эукариотов и некоторых бактерий акцепторами
водорода в цепи переноса электронов к кислороду являются
цитохромы. Для некоторых бактерий, например молочнокислых,
путь электронов к кислороду через флавопротеиды изучен еще
недостаточно полно. Для Klebsiella earogenes было найдено, что
содержание цитохрома а:2 - терминальной оксидазы -увеличи
валось в 200 раз при снижении напряжения растворенного кис
лорода от 5,3 мм рт. ст. до < 0,4 мм рт. ст. [119]; количества
цитохромов Ь и о мало зависели от напряжения растворенного кислорода. В культуре Candida цитохромы Ь и с обнаружены
вмаксимальных количествах при напряжении кислорода, рав
ном 1 мм рт. ст., а цитохром & - при напряжении растворенного
кислорода ниже 0,1 мм рт. ст. [219].
В клетках культуры Aspergillus nidulans были обнаружены
макси.мацьные количества некоторJ>rх ф~рментов гликолиза и
гексозомонофосфатного пути при нацряжении растворенного
кислорода ниже 30 мм рт. ст. [44].
11.6.Перехо,1t.ы от аэробного к анаэробному метаболизму
уфакультативных анаэробов
При переходе от анаэробного к аэробному росту индуцирует-
. ся синтез мно.гих различных ферментов и подавляется синтез
ферментов, необходимых для анаэробного роста [350]. К фер
ментам, индуцируемым аэробными условиями, относятся компо
ненты цитохромного пути переноса электронов, включая
убихинон и ферменты цикла трикарбоновых кислот; синтез
формиатгидрогенлиазы в этих условиях подавляется.
Метаболизм факультативного анаэроба, тако.го, как К. aero-
. genes, в состоянии лимитирования кислородом представляет
собой смешанный тип аэробного и анаэробного обмена. При кислых значениях рН эта культура в условиях лимитации кис лородом использует глюкозу с образованием исключительно
бутиленгликоля и двуокиси углерода; избыток кислорода подав ляет образование бути.11енгликоля, а анаэробные условия ведут
к накоплению в культуральной жидкости как бутиленгликоля,
. так и этанола [255].
Влияние кислорода на хультурь1 микроорганизмов |
137 |
Были сделаны попытки определить напряжение растворенного
кислорода, при котором осуществляется переход от аэробного
к анаэробному метаболизму в культурах К. aerogenes, растущих
на глюкозе Ll24]. В результате было установлено, что при
:.шачениях напряжения растворенного кислорода от 5 до 15 мм
рт. ст. q02 не зависит от напряжения кислорода, но дальнейшее
снижение напряжения растворенного кислорода приводит к не
ожиданному увеличению скорости дыхания примерно на 30%; это
ведет к -колебаниям напряжения растворенного кислорода и q02
Такая нестабильность в регуляции q02 может рассматриваться
как первый сигнал лимитации кислородом растущей культуры.
Данные других исследований показывают, что время, необ ходимое для перехода от стационарного состояния анаэробного роста к стационарному состоянию аэробного роста культуры К. aerogenes или Е. coli, приблизительно соответствует времени
двух генераций [122]; для обратного перехода от аэробного к
анаэробному состоянию требуется время, примерно равное трем
генерациям.
11.7. Влияние напряжения растворенного кислорода на прочие функции (кроме дыхания)
Для сохранения жизнеспособности клеток уксуснокислых бактерий необходим кислород: удаление кислорода из растущей культуры хотя бы только на 1 мин вызывало быструю гибель
бактерий [147].
Для поддержания максимальной скорости образования анти
биотика цефалоспорина грибом Cephalosporium напряжение рас творенного кислорода должно было быть не ниже 20 мм рт. ст.
[97], в то время как для дыхания критическое напряжение
растворенного кислорода составляло 8 мм рт. ст. Систематиче
ских исследований влияния концентрации растворенного кисло рода на образование антибиотиков и других вторичных метабо
литов проведено мало. Определенные данные по этому вопросу
могут быть получены, вероятно, лишь при использовании хемо
статных культур в стационарном состоянии. Некоторые примеры
таких исследований рассматриваются ниже.
Было найдено, что максимальное образование нерастворимо
го пигмента меланина в мицелии Aspergillus nidulans происхо
дит при напряжении растворенного кислорода выше 30 мм рт. ст.
Ниже 30 мм рт. ст. образуется растворимая форма пигмента,
которая выделяется. в среду, а максимальное количество
обнаруживалось при 18 мм рт. ст. [283]. Максимальное образо
вание дифтерийного токсина коринебактериями начинало
происходить, когда напряжение растворенного кислорода нахо
дилось в интервале от <0,1 до 100 мм рт. ст.; более высокий
138 Глава 11
уровень концентрации растворенного кислорода ингибировал
токсинообразование [276, 277]. Состав липидов Candida utilis
зависит от напряжения растворенного кислорода во время роста
культуры. Уменьшение напряжения растворенного кислорода от
5 до менее |
1 мм рт. ст. уменьшает соотношение жирных кис |
лот (C1s: С1в) |
и снижает степень ненасыщенности жирных кислот |
[32]. Уменьшение ненасыщенности может служить признаком
замены линоленовой кислоты, имеющей 3 двойные связи, на
олеиновую кислоту с одной двойной связью [9]. Образование
желтого флавиноподобного пигмента культурой Klebsiella aero-
genes увеличивалось при повышении напряжения ] астворенного
кислорода по крайней мере дQ 450 мм рт. ст. [ 123 . Эти резуль
тат~.~ свидетельствуют о том, что изучение влияния гипербари ческих давлений кислорода может представить интерес в отно шении образования продуктов метаболизма.
11.8. Заменители кислорода
Культура может снабжаться кислородом в форме перекиси
водорода, благодаря индукции очень высокого содержания в
организме каталазы [ 133]. В отсутствие кислорода нитраты,
феррицианид, тетратионат и некоторые восстанавливающиеся
органические соединения, такие, как метиленовая синь и тетра
золий, способны функционировать как конечные акцепторы электронов. Кислород ингибирует клеточные реакции с другими
акцепторами электронов. Восстановление нитратов, подобно ис
пользованию кислорода, сопряжено с образованием АТФ в клетках Klebsiella при использовании глюкозы в качестве источ
ника энер1·ии. Для этой реакции характерна следующая стехио-
метрия: NOз -+N02 +3 АТФ [116]. Этот процесс отличается от
процесса, протекающего с участием кислорода, в том отношении,
что ферменты цикла трикарбоновых кислот в этом случае инги бированы и глюкоза окисляется только до ацетата.
Если в культурах Klebsiella роль кислорода выполняет феррицианид, то ферменты цикла трикарбоновых кислот не по
давляются, так что глюкоза окисляется полностью; однако
восстановление феррицианида не сопряжено с образованием
АТФ [115]. Следовательно, рост Кlebsiella на глюкозе в присут ствии феррицианида зависит от образования АТФ в ходе глико
лиза. Как нитрат, так и феррицианид, подобно кислороду, по
давляют синтез фермента формиатгидрогенлиазы.
11.9. Ингибирование кислородом
Имеются немногочисленные данные об ингибирующем уровне
растворенного кислорода, однако все они указывают, что для
каждого организма характерно определенное напряжение рас-
140 |
Глава 11 |
глюкозой; было установлено, что напряжение растворенного кислорода, равное 1 атм, предотвращает рост Е. coli [246}. Рост
Pseudomonas, Escherichia и Staphylococcus, по данным других
исследователей [351], тормозился также при напряжении кисло
рода около 1 атм. Рост гриба Penicillium chrysogenum в фермен тере с перемешиванием ингибировался напряжением кислорода
в 1,5 атм -такое напряжение кислорода вызывало появление гиф с морфологическими отклонениями от нормы (Перт, неопу•
бликованная работа). Таким образом, ингибирующие значения
напряжения растворенного кислорода для аэробов могут быть достаточно низкими, чтобы в больших ферментерах индустри
ального масштаба проявлялась токсичность кислорода, особенно
благодаря избыточному давлению, поддерживаемому в верхней
части.
Молекулярные основы токсичности кислорода не ясны. Пред
лагаются различные гипотезы для объяснения действия кислоро
да, но унифицированной гипотезы пока не выработано. В основе
одной из гипотез лежит предположение, что токсичность кисло
рода обусловлена накоплением перекиси водорода клетками.
Такое накопление было обнаружено у Streptococcus faecalis
[295]. Перекись водорода может быть удалена и токсичность,
таким образом, снижена действием каталазы или пероксидазы,
которые способны индуцироваться наличием перекиси. Согласно второй гипотезе, кислород непосредственно ингибирует какой-то важный фермент, связывая или окисляя его. По третьей гипо тезе, кислород окисляет кофермент, такой, как ферредоксин, и,
следовательно, инактивирует его.
11.10. Анаэробный рост
11.10.1.Методы анаэробного культивирования
Облигатными анаэробами называются организмы, рост кото
рых ингибируется кислородом при любых значениях напряжения растворенного кислорода. Воздух при атмосферном давлении
полностью ингибирует рост таких организмов и для многих из
них - летален.
Создать более или менее строгие анаэробные условия можно
различными методами и средствами [141, 150, 348]. Достаточно
эффективна замена воздуха азотом или двуокисью углерода, не
содержащими кислорода. В любом случае в газовой фазе долж
но присутствовать некоторое количество двуокиси yr лерода
(5%). Газовая смесь водороддвуокись углерода удобна для
заполнения анаэростатов, в которых остаточный кислород может
быть удален путем каталитического связывания с водородом.
Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением