С.Дж.Перт
.pdfОбразование проаукта в культурах микроорганизмов |
201 |
болитов из биомассы за счет диффузии; 3) обратимая фермента
тивная инактивация какого-либо фермента, как это описано для r.11утаматсинтетазы [143]; 4) необратимый распад какого-то су
щественного фермента. Особенно важен четвертый с.11учай [320]. Затухание скорости образования пеници.11.11ина у Penicillium chrysogenum происходит при скоростях роста ниже чем 0,014 ч-1
[261 ], а скорость затухания, ес.11и рост прекращается, изменяет
ся |
обратно пропорциона.11ьно предшествующей скорости роста. |
В |
от.11ичие от этого потеря 3-кетодеrидрогеназной активности в |
нерастущих к.11етках Agrobacterium не зависит от предшествую
щей скорости роста [181]. В пос.11еднем с.11учае субстрат, .11ими
тирующий рост, имеет некоторое в.11ияние на скорость затуха ния: она меньше при .11имитировании роста уг.11еродом и бо.11ьше при .11имитировании фосфатом.
Нерастущим к.11еткам свойствен распад ферментов, связан ный с обнов.11ением белковых молекул. Поэтому, используя ин
гибиторы обновления белковых мо.11екул, можно уменьшить
распад ферментов. Изменения свойств биомассы при прибли жении скорости роста к нулю обсуждаются в гл. 18.
16.7. Влияние окружающих условий на образование микробных продуктов
16.7.1. Общие замечания
Влияние факторов внешней среды на образование продуктов при ферментации, за небольшим исключением, можно выразить
с помощью конечной или максимальной концентрации продук
тов. Однако этот конечный эффект предопределяется следую
щими независимыми фа-к-горами: 1) концентрацией биомассы;
2) удельной скоростью образования продукта Qp; 3) выходом
продукта из субстрата Ypts; 4) длительностью синтетической
активности и 5) скоростью распада продукта. В конечном счете
оптимизацию можно анализировать, исходя из этих пяти факто
ров. Значение удельной скорости роста биомассы связано глав
ным образом с влиянием на qp.
Ус.11овия, оптимальные для роста и индукции синтетической
активности, могут отличаться от условий оптимальных для об разования продукта. Таким примером служит образование рибо• флавина (разд. 13.5).
Чтобы увеличить образование продукта, следует использо
вать влияние самых различных факторов. Влияние физико-хими ческих факторов, температуры, рН, тоничности и напряжения
растворенного кислорода обсуждается в специальных главах,
посвященных этим факторам. Из питательных веществ важное
202 |
Глава 16 |
значение имеют следующие факторы: природа субстратов, осо
бенно в случае источников углерода и азота; концентрации суб
стратов (находится ли этот субстрат в концентрации, лимити
рующей рост организма, или нет); доставка предшественников
продукта и стимуляторов.
16.7.2. Источники углерода и энергии
Избыток определенного источника углерода или энергии ин
гибирует образование продукта, вероятно, с помощью механиз
ма, известного под названием катаболитной репрессии [77].
Примерами катаболитной репрессии могут служить ингибиро
вание избытком r люкозы образования пенициллина и образова
ния дифтерийного токсина [277]. Репрессию можно преодолеть
с помощью эмпирического подбора источника углерода, напри мер, для образования пенициллина взять лактозу, а для диф
терийного токсина --мальтозу. Можно также непрерывно до
бавлять источник углерода, так, чтобы он не был в избытке.
Использование смешанных источников углерода может дать
лучший выход, чем использование какого-нибудь одного источ
ника углерода. Например, добавление ацетата в среду с глю
козой увеличивает образование глутаминовой кислоты у видов
Corynebacterium [5]. Установлено, что для ферментации анти
биотиков часто лучшими средами являются смеси углеводов
с жирами, чем одни углеводы.
16.7.3. Источники азота
Обычно используют такие источники азота, как аммиак,
нитрат, аминокислоты, пептон и белки. У видов Corynebacterium
избыток аммиака ингибирует образование глутаминовой кисло
ты, поэтому аммиак добавляется отдельными порциями [169, стр. 267]. У видов же Brevibacterium, напротив, высокая кон
центрация ионов аммония благоприятствует образованию L-про
лина [230]. Комплексные источники азота, такие, как кукуруз
ный экстракт, белки зерновых, рыбная мука, часто стимулируют образование вторичных метаболитов, но механизм этого дейст
вия еще не ясен.
16.7.4. Дефицит источников питания
Образование продукта часто стимулируется созданием дефи
цита источников питания. Лимитация фосфатом стимулирует в
некоторых случаях биосинтез антибиотиков [77]. Дефицит по
микроэлементам стимулирует образование лимонной кислоты у
Образояание продукта в культурах микроорганизмов |
203 |
Aspergillus niger и рибофлавина у дрожжей. Необходимо сле
дить, чтобы действие лимитации субстратом не маскировалось
другими ингибирующими эффектами, такими, как катаболитная репрессия, вызванная избытком других субстратов.
Дефицит по биотину стимулирует сверхсинтез глутамата у
видов Corynebacterium. Это действие приписывается увеличению
проницаемости плазматической мембраны для глутаминовой
кислоты [169, стр. 314]. В присутствии избытка биотина внутри
клеточняя концентрация глутаминовой кислоты повышается, но
при этом плазматическая мембрана препятствует выходу этой
аминокислоты из клетки [77]. Выделение глутаминовой кисло
ты из бактерий, растущих в среде с избытком биотина, может быть вызвано добавлением в среду пенициллина или поверхно
стно-активных веществ. Этот эффект объясняется, по-видимому,
разрушением поверхностных слоев бактерий, что сказывается на
проницаемости мембран [ 169].
16.7.5. Предшественники продукта
Добавление предшественника продукта часто стимулирует об
разование продукта. Лучшим примером служит стимуляция об разования пенициллина при добавлении фенилуксусной кислоты,
образующей боковую цепь пенициллина G. Предшественник
увеличивает qpen в несколько раз и ведет к преимущественному
образованию пенициллина G по сравнению с другими пеницил
линами. Другие примеры предшественников продукта, стимули
рующих ферментацию, рассматриваютси в работе Димейна [771-
16.7.б. Стимуляторы
Стимуляторами называются соединения, которые, не являясь
предшественниками продукта, способны стимулировать образо
вание специфичных продуктов. Обзор данных об использовании
таких стимуляторов можно найти в работе Перлмана [236]. ,Яр
ким примером служит использование метионина или его аналога
норлейцина для стимуляции образования цефалоспорина С [87].
Барбитураты направляют биосинтез рифамицина в сторону
образования его определенного производного [201]. Окисление
микроорганизмами холестерина в андростадиен-3, 17-дион сти
мулируется комплексообразующими агентами [236]. Образова
ние лимонной кислоты у Aspergillus стимулируется метанолом
и пропанолом [220]; не исключено, что этот эффект обусловлен
влиянием на проницаемость мембраны. В связи с этим следует
отметить, что поверхностно-активные вещества стимулируют как
сверхсинтез рибофлавина у дрожжей [76], так и образование
204 Глава /fi
некоторых ферментов, участвующих в первичной атаке субстра.
та [273]. Бензилтиоционат стимулирует образование хлор
тетрациклина [ 145]. Образование деметилтетрациклина стиму~
лируется добавлением в культуру сульфонамидов или этионина,
ингибирующих ферментативное метилирование. Бензимидазол
ингибирует рост Saccharomyces |
cerevisiae и вызывает выделение |
ксантина [94]. |
. |
В общем можно сказать, что механизм действия стимулято
ров неизвестен и что некоторые из них, по-видимому, действуют
путем ингибирования или активации специфических фермента• тивных реакций.
Глава 17
ДЕАСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ
ИАКТИВАТОРОВ РОСТА
17.1.Введение
Вбольшинстве работ, посвященных метаболическим ингиби
торам, внимание исследователей было сфокусировано на их качественном действии и соответствующих молекулярных меха
низмах. Здесь же особое внимание будет уделено количествен
ным эффектам и возможному использованию ингибиторов для изменения ферментативных процессов (см. также разд. 16.7).
Очевидно, под действием того или иного ингибитора роста
происходят и фенотипические изменения и селекция генетиче
ских вариантов с повышенной устойчивостью к данному ингиби
тору, что поддерживает скорость роста на прежнем уровне. Мо
дель автосинтетической системы (разд. 24.2.1) предсказывает,
что временно после добавления ингибитора скорость роста будет
колебаться. Такое поведение наблюдалось у Klebsiella aerogenes в ответ на добавление барбитона (2 r/л), вызывающего затхха
ющие колебания скорости роста в течение шести генераций L73].
Модель автосинтеза Хиншельвуда (разд. 24.4) предсказывает,
что ингибитор роста будет так изменять ферментативную актив ность клетки, что скорость роста будет максимально возможной в данных условиях. В пользу этого предсказания говорит следу ющее: активность некоторых ферментов пентозофосфатноrо пути
у К. aerogenes при добавлении барбитона повышалась в 2,4 раза. Простая теория ответной реакции микроорганизмов на ингиби торы роста может быть основана на кинетике ингибирования
ферментов. В этом подходе мы делаем упрощающее предполо жение, что биомасса ведет себя как фермент, реагирующий с
лимитирующим рост субстратом. Согласно существующим пред
ставлениям, при конкурентном ингибировании ингибитор конку рирует с лимитирующим субстратом за поглощение биомассой. При неконкурентном ингибировании ингибитор, по-видимому, реагирует с биомассой в другом участке, отличном от того, в котором происходит поrлощение субстрата, и не оказывает
влияния на сродство биомассы к субстрату. Ингибирование, со
четающее в себе особенности конкурентного и неконкурентноrо
типа, не рассматривается в данной модели. Однако влияние
налидиксовой кислоты на рост Klebsiella, лимитированный
206 Глава 17
магнием, относится, по-видимому, к этому типу, поскольку про
является в увеличении К. и уменьшении µт. Кроме ингибито•
ров, добавляемых в среду, роль ингибиторов могут играть как
образующиеся в культуре продукты, так и используемые суб
страты. Однако очевидно, что нет достаточных оснований еще более расширять и усложнять модели, если простейшая из них
не удовлетворяет экспериментальным данным.
Активаторами роста называют соединения, которые, не буду
чи необходимыми для роста, могут увеличивать максимальную
скорость роста. Суще~ование таких активаторов роста уста
новлено еще недостаточно определенно, однако в случае некото
рых соединений имеются данные о том, что их можно отнести к
этой категории.
17.2. Конкурентное ингибирование
17.2.1. В периодической культуре
По аналогии с кинетикой ферментативных |
реакций [84, |
стр. 318] для реакции биомассы с субстратом, |
лимитирующим |
рост, можно написать
откуда следует, что
x+s +± xs, |
(17.1) |
Ks= [Х) [SJ/[XSJ, |
(17.2) |
где квадратные скобки означают концентрацию, а К.. - констан та диссоциации. Для взаимодействия биомассы с ингибитором 1
имеем |
|
Х + 1 ~ XI, |
(17.3) |
где предполагается, что I взаимодействует с ферментом в том
же участке, что и субстрат. Из диссоциации комплекса XI полу
чаем
К1 = [Х] [IJ/[XIJ.
Продукт Р образуется в соответствии с реакцией |
|
xs-P+ х. |
(17.4) |
Предполагается, что это процесс, лимитирующий скорость рос
та, т. е. скорость распада V = k [XS]. где k - константа. Общая
биомасса дается уравнением х = [Х] + [XS] + [XI]. Удельная
скорость потребления субстрата будет V/x = q. Из выражений
для концентраций реагирующих веществ, как и в кинетике фер
ментативных реакций L84, стр. 318], мы делаем вывод, что
удельная скорость потребления субстрата описывается следую
щим уравнением:
(17.5)
|
Действия химических ингибиторов и активаторов роста |
207 |
|||||
Qт здесьмаксимальная скорость |
потребления субстрата, ко |
||||||
торая |
получается, |
если |
биомасса |
насыщается |
субстратом, |
и |
|
а= l |
+ i/Ki, где i- |
концентрация ингибитора. Если У -эконо |
|||||
мический |
коэффициент, |
то, подставив q = и/У и |
Qm= µт/У |
из |
|||
уравнения |
(17.5), получим |
|
|
|
|||
|
|
|
µ = µms/(s +aKs). |
(17.6) |
|||
Уравнение (17.6) показывает, что при конкурентном ингибиро
вании Кв испытывает кажущееся увеличение в а. раз, а µm не
Врем.я
Рис. 59. Периодический рост с (+i) и без (-i) добавления конкурентного
ингибитора в среду.
изменяется. Ингибитор может воздействовать на сродство к
лимитирующему рост субстрату, взаимодействуя с биомассой в. участке, отличном от участка связывания субстрата. В этом
случае действие будет проявляться в увеличении Ks, но выра жение для а. будет другое (см. [84, стр. 320]). В периодической
культуре, согласно модели, ингибитор значительно расширяет
фазу затухания роста (рис. 59).
17.2.2. В хемостатной культуре
Если конкурентный ингибитор добавляется в хемостатную
культуру |
со скоростью разбавления |
D, то для |
стационарного |
|
состояния |
можем подставить µ = D в уравнение |
( 17.6), |
тогда |
|
|
s= аКР/(µт - |
D), |
|
(17.7) |
|
i=Y(sг-s), |
|
|
(17.8) |
где У - экономический коэффициент, |
s, - концентрация |
лими- |
||
Действия химических ингибиторов и активаторов роста |
209 |
||
цесс можно описать следующими реакциями: |
|
|
|
Х+ S +± XS, |
|
(17.11) |
|
Х + 1 +± |
XI, |
|
(17.12) |
XS + 1 +± |
IXS, |
|
(17 .13) |
XI + S :+:t: IXS. |
|
(17.14) |
|
Предполагается, что реакции (17.12) |
и (17.13} |
имеют одну и ту |
|
же константу диссоциации Ki, а реакции (17.11) |
и (17.14)-одну |
||
Время
Рис. 111.Периодический рост с (+t) и без (-i) некоикуреитиого ингибитора
добавляемого в среду.
и ту же константу диссоциации Ks- Предполагается также, что комплекс IXS не может распадаться и давать продукт, т. е.
продукт получается только в реакции |
|
|
XS-+ |
Х + Р. |
(17.15) |
Считается, что эта реакция ограничивает скорость процесса в
целом. Записывая выражения для концентраций реагирующих
веществ [84, стр. 322] и подставляя уравнение для удельной
скорости поглощения субстрата q через µ, получаем
µ = µms/a(s + Ks), |
(17.16) |
где, как и ранее, а= 1 + i/Ki- Отсюда следует, что действие
ингибитора проявляется в уменьшении максимальной удельной
скорости роста, а Ks не изменяется. Если s ~ Ks, то из уравне
ния ( 17.16) получим µ = µm/a. Это действие в периодической
культуре (рис. 61) наблюдалось ПJ:!И ингибировании роста
Escherichia coli сульфонамидами [ 172J. Действие сульфонамида
