Иммунохимическая окраска мембраны после проведения электропереноса и нанесения образцов на дот Реактивы
Блокирующий буфер: 10 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащий 3% сухого обезжиренного молока. Для приготовления 100 мл блокирующего буфера необходимо 3 г сухого обезжиренного молока, 10 мл 0,1 М трис- HCl, 10 мл 1 М NaCl и 80 мл дистиллированной воды.
Буфер для промывки: 10 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащий 0,1% твин20. Для приготовления 1 л буфера для промывки необходимо 900 мкл твин20, 100 мл 0,1 М трис- HCl, содержащего 0,1 % твин20, 100 мл 1 М NaCl, и довести дистиллированной водой до 1л.
Буфер для разведения антител и коньюгатов: 10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 0,3% сухого обезжиренного молока. Для приготовления 200 мл буфера необходимо 20 мл блокирующего буфера, 18 мл 0,1 М трис- HCl, 18 мл 1 М NaCl и 144 мл дистиллированной воды.
Буфер для пероксидазной реакции: 50 мМ трис-HCl, pH 7,4
Раствор субстрата: 0,1 %-ный диаминобензидина в 50 мМ трис-HCl, pH 7,4, содержащий 0,02 % H2O2 (готовится непосредственно перед использовнием)
Ход работы
1) Нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в блокирующем буфере в течение 30 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).
2) Дважды ополаскивают буфером для промывки.
3) Исходная концентрация первых антител:
антитела к Лф: 0,27 мг/мл
антитела к МПО: 0,11 мг/мл
Для инкубации мембран необходимо по 15 мл раствора на чашку, следовательно, для 4 чашек нужно по 30 мл разведенных в буфере антител. При приготовлении раствора антител к Лф к 30 мл буфера для разведения проб было добавлено 120 мкл антител к Лф.
При приготовлении раствора антител к МПО к 30 мл буфера для разведения проб было добавлено 280 мкл антител к МПО. Таким образом конечная концентрация антител в пробах составила
антитела к Лф: 1,08 мг/мл
антитела к МПО: 1,02 мг/мл
Мембраны инкубируют в растворе первых антител в течение 60 минут при +37°С в термостате на качалке.
4) Тщательно отмывают от не связавшегося антигена буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.
5) Для инкубации дотов с вторичными антителами в 30 мл буфера для разведения проб добавляют 30 мкл антивидовых антител козы к антителам кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена.
Для инкубации блотов в 30 мл буфера для разведения проб добавляют 30 мкл вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и разведенных в 100 раз (30 мкл), и 15 мкл StrepTactin, конъюгированного с пероксидазой хрена.
Мембраны инкубируют в течение 60 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).
6) Тщательно отмывают от несвязавшегося конъюгата буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.
7) Мембраны уравновешивают раствором для пероксидазной реакции в течение 5 мин при комнатной температуре, желательно при перемешивании.
8) Мембраны инкубируют в растворе субстрата, не допуская прямого попадания яркого света, и наблюдают за развитием окраски.
Реакцию останавливают промыванием мембраны дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
Результаты:
Таблица1. Концентрация МПО в образцах при дот-иммуноферментном анализе.
Образец |
Концентрация МПО в образце, мг/мл |
Слюна |
0,016 |
Экстракт 1 |
1,7 |
Экстракт 2 |
1,74 (0,69) |
Экстракт 3 |
0,9 |
Молоко человека |
2,25 (4,4) |
Слезы |
6,1 |
Таблица 2. Концентрация ЛФ в образцах при дот-иммуноферментном анализе.
Образец |
Концентрация ЛФ в образце, мг/мл |
Слюна |
0,2 |
Экстракт 1 |
0,7 |
Экстракт 2 |
0,4 |
Экстракт 3 |
0,4 |
Молоко человека |
0,4 |
Слезы |
0,7 |
Рисунок 1. Дот-ИФА
