Электрофорез

Электрофорез проводился при силе тока 25 мА на электрофоретическую камеру от катода к аноду. За ходом проведения электрофореза наблюдали по положению красителя бромфенолового синего. Электрофорез останавливали, когда краситель находился около нижней границы разделяющего геля (приблизительно через 1час 10 минут).

После проведения электрофореза 2 геля фиксировали 15 минут в 50% этаноле в контейнере. А затем окрашивали в Кумасси G-250 (0,1% Кумасси, 40% этанол, 5% уксусная кислота) в течение 40 минут. От избытка красителя гели отмывали в 5% уксусной кислоте. Процедуры фиксирования белков в геле, окрашивания и отмывки проводили на качалке при комнатной температуре. Белки с оставшихся четырёх гелей переносли на нитроцелюлозную мембрану.

Нанесеы следующие препараты: CM; GM; HM; Ё М, Ст, Ю, Э1, Э2, Э3.

М олекулярные массы маркеров : 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 кДа

Электроперенос белковых фракций на нитроцеллюлозную мембрану

1. Волокнистые подложки, фильтровальную бумагу для переноса (в течение ночи) и 4 нитроцеллюлозные мембраны для переноса (в течение 10 минут) вымачивали в буфере для переноса (0,192 М глицин – 0,025 М трис, рН 8,3.) (была проведена предварительная обработка мембран: 10 минут ее вымачивали в дистиллированной воде).

2. Далее в указанном ниже порядке собирали кассету для переноса.

Черная пластинка кассеты «катод»

Волокнистая подложка

Фильтровальная бумага для переноса

Полиакриламидный гель

Мембрана

Фильтровальная бумага для переноса

Волокнистая подложка

Прозрачная пластинка кассеты «анод»

Для удаления пузырей воздуха по фильтровальной бумаге для переноса прокатали пробиркой.

Кассету закрывали

.

3. В прибор для электропереноса помещали магнит

4. .В прибор для переноса помещали кассету.

5. В прибор для переноса помещали охлаждающий элемент, который предварительно заморозили.

6. Электроперенос проводится в течение 90 минут от «-» к «+» при силе тока 800 мА на две камеры (70В).

6. Камеру для переноса ставили на мешалку

После переноса гели помещали в контейнер, фиксировали 15 минут в 50% этаноле в контейнере. А затем окрашивали в Кумасси G-250 (0,1% Кумасси, 40% этанол, 5% уксусная кислота) в течение 40 минут. От избытка красителя гели отмывали в 5% уксусной кислоте ) для проверки качества элетропереноса.

С мембран тщательно удаляли остатки геля. 2 мембраны поместив на фильтровальную бумагу (рабочей поверхностью наверх) высушивали и хранили в течение ночи для последующей обработки антителами, а две мембраны окрашивали на белки

Окраска мембраны на белки

Мембраны помещали в чашки Петри и окрашивают на белок раствором Понсо (2% Понсо, 30% трихлоруксусная кислота, 30% сульфосалициловая кислота) в течение 8 минут на качалке при комнатной температуре. Отмывали мембрану дистиллированной водой. После отмывки мембрану высушивали и хранили.

Иммунохимическая окраска мембраны после проведения электропереноса.

Нитроцеллюлозные мембраны инкубировали в 15 мл блокирующего буфера (10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 3% сухого обезжиренного молока) в течение 30 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).

Дважды ополаскивали буфером для промывки (10 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащий 0,1% tween-20)

Инкубировали мембрану в растворе первых антител (120 мкл антител к лактоферрину (с концентрацией 270 мкгр/мл) или 280 мкл антител к миелопероксидазе (с концентрацией 110 мкгр/мл) в конечной концентрации 1 мкг/мл) на буфере для разведения антител (10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 0,3% сухого обезжиренного молока) в течение 60 минут при +37°С в термостате на качалке.

Отмывали от не связавшегося антигена буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.

Мембрану инкубировали в растворе вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, разведенных в 1000 раз (30 мкл вторых антител на 2 мембраны) и стрептавидина, разведённого в 2000 раз (15 мкл стрептавидина на 2 мембраны ) на буфере для разведения антител в течение 60 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке).

На гель были нанесены следующие пробы:

1- CM

2- GM

3- HM

4- Ё

5- M (250; 150; 100; 75; 50; 37;25 кДа)

6- Ст

7- Ю

8- Э1

9- Э2

10- Э3

П римечание: при иммунохимической окраске мембран были перепутаны мембраны – мембрану с нанесенным в качестве стандарта лактоферрином обработали антителами к миелопероксидазе и наоборот, т.е. 6-е дорожки содержат отрицательный контроль.

Выводы:

-1.Все используемые нами пробы кроме стандартов белков по результатам окраски гелей Кумасси содержат большое количество белков с различными молекулярными массами.

-2. При окраске мембран Понсо на 6 дорожке (см. мембрану I-2) с нанесенным в качестве стандарта лактоферрином окрасилась единственная полоса с молекулярным весом около 80 кДа, на дорожках 1, 2, 3 , 4 и 8,10 – видна полоса белка со сходным молекулярным весом (это препараты – молоко коровы, козы, человека, слезы и экстракт №1,№3).

При окраске мембран Понсо на 6 дорожке (см. мембрану II-2) с нанесенной в качестве стандарта миелопероксидазой окрасилась единственная полоса с молекулярным весом около 60 кДа, на дорожках 3, 8, 9 и 10 – видна полоса белка со сходным молекулярным весом (это препараты – молоко человека, экстракт №1, №2, №3).

- 3.Стрептавидин с пришитой пероксидазой хрена связался биотином на всех маркерах молекулярных масс, но также связался и с близлежащими участками мембраны.

.- 4. При иммунохимическом окрашивании мембраны антитела к лактоферрину связались с белком с молекулярной массой около 80 кДа в следующих препаратах: молоко человека, слезы, экстракты лейкоцитов 1 и 3 и не связались с белком на дорожке№6, где был нанесен стандарт - миелопероксидазы. Это может свидетельствовать о том, что наши антитела к ЛФ были достаточно чистыми, или/и

о том, что препарат молока человека (дорожка 3), слез (дорожка 4) и экстракты лейкоцитов 1 и3 (дорожки 8 и 10 соответственно) содержат лактоферрин, гомологичный лактоферрину человека. Препараты молока козы (дорожка 1) и коровы (дорожка 2), слюны (дорожка 7) и экстракта лейкоцитов 2 (дорожка9) не содержат или содержат очень мало лактоферрина, гомологичного лактоферрину человека.

-4. антитела к миелопероксидазе связались с двумя полосками белка с молекулярными массами около 60 и 70 кДа в экстрактах лейкоцитов 1,2 и 3 (дорожки 8, 9, 10 соответственно). Так как в состав миелопероксидазы входят субъединицы с молекулярными массами 57 и 12 кДа, можно предположить, что полоса белка с молекулярной массой около 60 кДа содержит большую субъединицу миелопероксидазы, а полоса белка с молекулярной массой около 70 кДа содержит неразъединившиеся большую и малую субъединицы миелопероксидазы. Полоса, соответствующая молекулярной массе 70 кДа менее интенсивная, т.е. DTT не полностью восстановил дисульфидные связи между большой и малой субъединицами, и МПО осталась в комплексе из 2-х субъединиц, при этом белка в полосе с молекулярной массой около 60 кДа больше, полоса, соответствующая малой субъединице не регистрируется.