Санкт-Петербургский государственный университет

Биолого-почвенный факультет

Кафедра биохимии

Отчет по практикуму по иммунохимии

(02.12.2008 — 11.12.2008)

Подготовили студенты II курса магистратуры

А. Барабанова,

И. В. Войнова,

К. Н. Данилова,

К. Е. Карпачева,

А. Б. Комиссаров,

В. Б. Филимонов,

О. В. Черкалина

Санкт-Петербург

2008

Иммуноэлектрофорез сыворотки крови

Реактивы

0,1% Раствор агарозы на воде

1% Агароза на 0,05 м трис-hCl буфере, рН 8,2

Электродный буфер: 0,05 М трис-HCl буфер, рН 8,2

Буфер для разведения сывороток: 0,01 М натрий фосфатный, pH 7,4

Раствор бромфенолового синего

Блокирующий буфер: 10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 3% сухого обезжиренного молока.

Буфер для промывки: 10 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7,4, содержащий 0,1% твин20.

Буфер для разведения антигенов и коньюгатов: 10 мМ трис-HCl, 100 М NaCl, pH 7,4, содержащий 0,3% сухого обезжиренного молока.

Раствор Понсо: 2% Понсо S, 30% трихлоруксусная кислота, 30% сульфосалициловая кислота.

Раствор субстрата (готовится непосредственно перед использованием): 0,067% 3-амино-9-этил-карбазол (АЭК), 17% этанол, 0,025% перекись водорода на воде.

Ход работы

Чистые, сухие стекла погрузили в 0,1% раствор агарозы на воде и аккуратно высушили в вертикальном положении. Разместили стекла на установленном горизонтально столике для заливки. 1%-ную агарозу расплавили. Гоpячий раствор 1% агарозы заливали по 3 мл на стекло. Толщина геля пpи этом - 1-2 мм.

В середине застывшего геля с помощью усеченного наконечника формировали 2 лунки. В одну лунку вносили цельную сыворотку, в другую – эту же сыворотку, но разведенную в 2 раза 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4 (см. табл. 1). Всего приготовили 12 гелей (гели 1–6 и 1’–6’ содержали одинаковые пробы, но были предназначены для электрофореза различной продолжительности).

Табл. 1. Иммуноэлектрофорез сыворотки крови. Нанесение проб

Гель-стекло	Лунка 1	Лунка 2	Окрашивание после переноса на мембрану
1, 1’	сыворотка №1 к лактоферрину	те же сыворотки, разведенные в 2 раза	окраска Понсо S
2, 2’	сыворотка №1 к лактоферрину		иммуноокрашивание
3, 3’	сыворотка №3 к лактоферрину		иммуноокрашивание
4, 4’	сыворотка №2 к миелопероксидазе		окраска Понсо S
5, 5’	сыворотка №2 к миелопероксидазе		иммуноокрашивание
6, 6’	сыворотка №4 к миелопероксидазе		иммуноокрашивание

Объем вносимых проб - 20 мкл (реально в лунки попадало 12-15 мкл). К пробам добавили произвольное количество лидирующего красителя бромфенолового синего.

Стекла поместили на подложку, а затем в камеру для иммуноэлектрофореза.

Электрофорез проводили пpи силе тока 20 мА (100 V); начинали форез при силе тока 10 мА. За ходом электрофореза следили по положению красителя бромфенолового синего.

Электрофорез в первой камере остановили, когда бромфеноловый синий достиг середины между краем стекла и лунки, во второй камере – когда бромфеноловый синий был у края стекла. (Приблизительное время электрофореза 1,5 и 2,5 часа соответственно).

После проведения электрофореза стекла с гелями расположили горизонтально, у всех гелей отрезали верхний правый уголок; на гели сверху положили нитроцеллюлозные мембраны, далее слой фильтровальной бумаги толщиной 1-2 см, сверху поставили груз: около 5 кг. Перенос проводили в течение 35 минут.

Мембраны с номерами 1, 4, 1’, 4’ – окрашивали красителем Понсо, выявляя тотальные белки. Остальные мембраны окрашивали иммунохимически (выявляли антитела к данным антигенам).

Окраска мембран на белки

Мембраны помещали в чашки Петри и окрашивали на белок раствором Понсо S в течение 5 минут на качалке при комнатной температуре. Отмывали мембрану дистиллированной водой. (см. рис. 1)

Иммунохимическая окраска мембран

Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в блокирующем буфере в течение 30 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате, на качалке).

Происходит блокирование свободных участков мембраны, не занятых белками после переноса. Это препятствует неспецифическому связыванию антител с мембраной.

Дважды ополаскивали буфером для промывки. Затем инкубировали мембрану в растворе антигена (1 мкг/мл) в течение 60 минут при +37°С в термостате на качалке. Тщательно отмывали от несвязавшегося антигена буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.

Мембрану инкубировали в растворе первичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, разведенных в 300 раз, в течение 60 минут при +37°С, при перемешивании (в термостате на качалке). Тщательно отмывали от несвязавшегося коньюгата буфером для промывки 3 раза по 5 минут на качалке при комнатной температуре.

Мембрану споласкивали водой и инкубировали в растворе субстрата, не допуская прямого попадания яркого света, наблюдая за развитием окраски. Реакцию останавливливали промыванием мембраны дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Рис. 1. Мембраны, окрашенные красителем Понсо (мембраны 1, 4, 1’, 4’)

Рис. 2. Мембраны 2, 2’, 3, 3’, 5, 5’, 6, 6’

Результаты и обсуждение

В сыворотке были выявлены антитела к лактоферрину и миелопероксидазе человека. Иммуноглобулины (IgG) малоподвижны, иммунохимически выявляются в зоне старта. Медленно двигались к катоду (см. рис 2). Возможно, низкая электрофоретическая подвижность иммуноглобулинов объясняется малой разницей между значениями их pI и pH электродного буфера Тотальный белок выявляли окрашиванием Понсо S (см. рис. 1) Альбумины в данной электрофоретической системе обладали высокой подвижностью и перемещались к аноду.