Количественное определение антигенов (миелопероксидазы или лактоферрина) методом твердофазного иммуноферментного анализа (elisa) («сандвич» вариант) Реактивы

1) 0,2 М трис-HCl, буфере, рН 8,9;

2) 0,01 М натрий фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, рН 7,4;

3) Блокирующий буфер: раствор 1% бычьего сывороточного альбумина в 0,01 М натрий фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, рН 7,4;

4) Реакционная смесь: раствор 0,02 % орто-фенилендиамина и 0,015 % перекиси водорода, в буфере, содержащим цитрат и фосфат натрия в концентрации 0,1 М и 0,2 М соответственно, рН 5,0

5) Раствор для разведения антигенов и конъюгатов: раствор 0,1% бычьего сывороточного альбумина в 0,01 М натрий фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,4.

Ход работы

Поликлональные антитела к антигену (8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,1 мкг/мл в 0,2 М трис-HCl, буфере, рН 8,9) внесли в лунки 96-луночного планшета по 100 мкл и инкубировали 3 при 37°С в термошейкере.

С помощью промывателя удалили содержимое лунок, и лунки промыли 10 раз дистиллированной водой.

Лунки заполнили раствором 1 % бычьего сывороточного альбумина в 0,01 М натрий фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, рН 7,4 (200 мкл в лунку) и инкубировали 1 ч при 37°С в термошейкере.

С помощью промывателя удалили содержимое лунок, и лунки промыли 10 раз дистиллированной водой.

Добавили по 100 мкл стандартных проб с концентрацией антигена 100 нг/мл. Для разведения образцов использовали раствор 0,1% БСА.

Планшет инкубировали 1,5 часа при температуре 37°С в термошейкере.

С помощью промывателя удалили содержимое лунок, и лунки промыли 10 раз дистиллированной водой.

В лунки внесли 100 мкл разных конъюгатов антител с пероксидазой хрена в разведениях в 50; 100; 200 раз (разводили пробы на 0,1% БСА). Схема планшета приведена ниже.

Конц. АТ. к МПО	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
контроль
8
4
2
1
0.5
0.25
0.1
	№10		№10		№12		№12		№14 (в 1 раз)		№14 (в 2 раза)

.

Конц. АТ. к ЛФ	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
контроль
8
4
2
1
0.5
0.25
0.1
	№6		№6		№6		№9 (в 2 раза)		№9 (в 1 раз)		№9 (в 0.5 раза)

Планшет инкубировали 2 часа при температуре 37°С в термошейкере. С помощью промывателя удалили содержимое лунок, и лунки промыли 10 раз дистиллированной водой.

Добавили в каждую лунку реакционную смесь, которая состоит из 0,02 % орто-фенилендиамина и 0,015 % перекиси водорода, растворенных в буфере, содержащем цитрат и фосфат натрия в концентрациях 0,1 М и 0,2 М соответственно, рН 5,0 (по 100 мкл). Реакция шла в темноте в течение 16 минут.

Реакцию остановили, добавив серную кислоту до конечной концентрации 0,83 М (по 50 мкл 2,5 М H₂SO₄ в лунку).

Результаты реакции определяли колориметрически с помощью многоканального спектрофотометра, измеряя оптическую плотность при длине волны 492 нм.

Исходя из колориметрических измерений был выбран коньюгат к ЛФ №9 разведенный в 2 раза и коньюгат к МПО №14 разведенный в 2 раза. Данные коньюгаты были использованы для определения концентрации АГ в исследуемых образцах.

ЭБЛ1	ЭБЛ	Слёзы	Слёзы	Слюна	Слюна	Мол.	Мол.	ЛФ (ЭФ)	ЛФ (ЭФ)	К	К
ЛФ Лёша	ЛФ Лёша
				ЛФ станд.
				ЛФ станд.

Разведение в: 2раза->2раза->2раза->2раза

Слюна	Слюна	Слёзы	Слёзы	ЭБ1	ЭБЛ	Мол.	Мол.	МПО (станд.)	МПО (станд.)	К	К