Двойная иммунодиффузия в геле Реактивы

Гель: 1% агаpоза на веpонал-ацетатном буфеpе рН 8,6. Для приготовления буфера необходимо 4,95 г веpонала натрия; 3,238 г 3-водного ацетата натрия на 500 мл Н₂О; pН 8,6, доводят уксусной кислотой.

Буфер для разведения проб: 0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4

Буфер для пероксидазной реакции: 50 мМ трис-HCl, pH 7,4. Для приготовления 500 мл буфера для пероксидазной реакции необходимо 60,5 г триса,около 400 мл дистиллированной воды, pH доводят соляной кислотой.

Реакционная смесь для МПО: 1 мг диаминобензидина, 0,5 мкл перекиси водорода (36%), 1 мл 50 мМ трис-HCl, рН 7,4 (готовится непосредственно перед использованием)

1 М хлорид натрия.

Кpаска для геля: 0,5% кумасси R-250, 10% уксусная к-та, 45% этанол.

Pаствоp для отмывания геля: 10% уксусная кислота, 45% этанол. Для приготовления 1 л раствора необходимо 100 мл уксусной кислоты, 450 мл этанола и 450 мл дистиллированной воды.

Ход работы

На установленном горизонтально столике для заливки размещают стекла и заливают горячий раствор 1% агарозы, 3 мл на стекло. Толщина геля при этом получается 1-2 мм.

В застывшем геле с помощью пробойника формируют лунки (1 лунка в центре, 6 – по кругу).

Стекла помещают на фильтровальную бумагу в чашки Петри.

Объем вносимых проб - 20 мкл.

ц – центральная лунка

1 – 6 лунки

I. Титрование сывороток

I.1) Титрование сывороток к лактоферину (Лф): в центральную лунку вносят Лф (0,5 мг/мл), в лунку 1 вносят сыворотку к Лф №1 или сыворотку к Лф №3, в остальные – сыворотку в различных разведениях (последовательные разведения в 2 раза: в лунку 2 сыворотку к Лф, разведенную в 2 раза буфером для разведения проб, в лунку 3 – в 4 раза и т.д.). Стекла I-1 и I-3.

I.2) Титрование сывороток к миелопероксидазе (МПО): в центральную лунку вносят МПО (0,5 мг/мл), в лунку 1 вносят сыворотку к МПО №2 или сыворотку к МПО №4, в остальные – сыворотку в различных разведениях (последовательные разведения в 2 раза: в лунку 2 сыворотку к МПО, разведенную в 2 раза буфером для разведения проб, в лунку 3 – в 4 раза и т.д.). Стекла I-2, I-4, I-2-ДАБ и I-4-ДАБ, 2 стекла для окраски гелей кумасси, 2 – для выявления пероксидазной активности МПО с помощью диаминобензидина (ДАБ).

II. Тестирование образцов на наличие антигена (данные образцы и сыворотки вносятся в исходной концентрации).

II.1А) В центральную лунку вносится сыворотка к Лф №1 или сыворотка к Лф №3, в лунку 1 – экстракт белков лейкоцитов №1, в лунку 2 – сыворотка молока человека, в лунку 3 - сыворотка молока коровы, в лунку 4 - сыворотка молока козы, в лунку 5 – слезы №1, в лунку 6 – слюна. Стекла II-1А и II-3А.

II.1В) В центральную лунку вносится сыворотка к Лф №1 или сыворотка к Лф №3, в лунку 1 – экстракт белков лейкоцитов №1, в лунку 2 – экстракт белков лейкоцитов №2, в лунку 3 – экстракт белков лейкоцитов №3, в лунку 4 – слезы №1, в лунку 5 – слезы №2, в лунку 6 – слюна. Стекла II-1В и II-1В.

II.2) В центральную лунку вносится сыворотка к МПО №2 или сыворотка к МПО №4, в лунку 1 – экстракт белков лейкоцитов №1, в лунку 2 – экстракт белков лейкоцитов №2, в лунку 3 – экстракт белков лейкоцитов №3, в лунку 4 – слезы №1, в лунку 5 – слюна, в лунку 6 – сыворотка молока человека. Стекла II-2, II-4, II-2-ДАБ и II-4-ДАБ, 2 стекла для окраски гелей кумасси, 2 – для выявления пероксидазной активности МПО с помощью ДАБ.

III. В центральную лунку вносится экстракт белков лейкоцитов №1, в лунки 1 и 6 - сыворотка к Лф №1, в лунки 2 и 5 - сыворотка к МПО №2, в лунку 3 - сыворотка к Лф №3, в лунку 4 - сыворотка к МПО №4. Стекла III и III-ДАБ, одно стекло для окраски геля кумасси, второе – для выявления пероксидазной активности МПО с помощью ДАБ.

Иммунодиффузия идет в течение ночи при комнатной температуре во влажной камере (необходимо смочить водой фильтровальную бумагу в чашке Петри, и таким образом, получаем влажную камеру). Стекла и чашки Петри необходимо подписать, чтобы впоследствии не перепутать.

Вынимаем фильтровальную бумагу из чашек Петри.

Ферментативное выявление миелопероксидазной активности

Для выявления МПО используют 5 стекол с меткой ДАБ.

В чашку Петри с 5 стеклами заливают буфер для пероксидазной реакции так, чтобы гель был покрыт сверху. Инкубируют 5 минут.

Сливают буфер.

Заливают реакционную смесь, которая готовится непосредственно перед реакцией. На одну чашку необходимо 15 мл реакционной смеси, для ее приготовления нужно 15 мг ДАБ, 12,5 мкл 24% перекиси водорода и 15 мл 50 мМ трис-HCl, рН 7,4.

Реакцию останавливают дистиллированной водой.

Окраска на белок

Стекла заливают 1 М NaCl и инкубируют в течение дня, чтобы удалить следы неспецифического взаимодействия.

Затем стекла промывают несколько раз дистиллированной водой для удаления соли.

Стекла помещают на поднос на фильтровальную бумагу. На фильтровальной бумаге под каждым стеклом подписывают его номер. На каждое стекло сверху кладут кусочек фильтровальной бумаги, размер которого соответствует размеру стекла. В течение 36 часов гель высушивают в термостате при +37С.

Стекла погружают вертикально с помощью пинцета в емкость с краской и окрашивают в течение 15-30 секунд.

Отмывают в растворе для отмывки до тех пор, пока четко не проявятся линии преципитации.

Затем стекла высушивают на фильтровальной бумаге. Если подписи стекол отмылись во время окрашивания необходимо снова их подписать.

Раствор для отмывки после использования необходимо регенерировать на угольном фильтре.

Результаты:

Выводы:

Результаты выявления антигенов в различных образцах:

Образец	Лф	МПО
сыворотка молока человека	++++	----
сыворотка молока коровы	+---
сыворотка молока козы	++--
слезы №1	++++	+---
слезы №2	++
слюна	+---	+---
экстракт белков лейкоцитов №1	++++	++++
экстракт белков лейкоцитов №2	++	+++-
экстракт белков лейкоцитов №3	+-	+++-

Появление двух и более полос преципитации может говорить о том, что в анализируемых сыворотках присутствуют антитела к нескольким антигенам содержащимся в образце, что произошло смещение геля, что произошла диссоциация субъединиц МПО (обе обладают антигенностью, но только одна обладает пероксидазной активностью). Чем ближе полоса преципитации к лунке, содержащей исследуемый образец, тем меньше данный образец содержит выявляемого антигена. Но если антигена очень мало, то полоса преципитации не образуется.

Рисунок. Двойная иммунодиффузия в геле.

Иммуноцитохимическое выявление миелопероксидазы и лактоферрина в клетках крови человека

Реактивы

Холодный ацетон

PBS: 0,01М фосфатный буфер,содержащий 0,15 М NaCl, pH 7,4

0,3% перекись водорода на метаноле

1% бычий сывороточный альбумин на PBS

Буфер для пероксидазной реакции: 50 мМ трис-HCL, pH 7,4

Реакционная смесь: 6 мг ДАБ + 10 мл 50 мМ трис-HCL, pH 7,4 + 10мкл 30% H₂O₂

Ход работы

Использовали готовые мазки крови человека на предметных стеклах (20 мазков). Фиксация препаратов осуществлялась холодным (+4ºС) ацетоном в течение 10 мин.

Препараты были разделены на пять групп:

1. К1 – контроль активности эндогенной пероксидазы (препараты 1, 2, 18).

2. К2 – контроль блокирования эндогенной пероксидазы (препараты 3, 4, 19).

3. К3 – контроль специфичности вторых антител (препараты 5, 6, 20).

4. Препараты для выявления лактоферрина (7, 9, 11, 13, 15, 17).

5. Препараты для выявления миелопероксидазы (8, 10, 12, 14, 16).

Ход работы отражен на схеме 1.

С х е м а 1

Фиксация ацетоном

К1

П ромывка PBS (3 раза по 5 мин)

Блокирование эндогенной пероксидазы