0,3% Раствором h2o2 в метаноле (20 мин)

К2

П ромывка PBS (1 раз в течение 5 мин)

К3

О бработка 1% BSA на PBS (60 мин)

7, 9, 11, 13, 15, 17

8, 10, 12, 14, 16

Нанесение АТ против лактоферрина Нанесение АТ против миелопероксидазы в 0,1% BSA на PBS (1 мкг/мл) . в 0,1% BSA на PBS (1 мкг/мл).

Инкубация в течение 60 мин Инкубация в течение 60 мин

Промывка PBS (3 раза по 5 мин)

Нанесение вторых антител, конъгированных с пероксидазой хрена в 0,1% BSA на PBS (разведение 1/300) Инкубация в течение 60 мин

Промывка PBS (2 раза по 5 мин)

Промывка буфером для реакции (2-3 мин)

Окрашивание реакционной смесью (10 мин, 500 мкл смеси на препарат)

Промывка H2O дист.

Результаты и обсуждение:

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №1 – контроль №1 – наличие эндогенной пероксидазной активности. Клетки лопнули. Слабая окраска содержимого цитоплазмы, ядро сегментарное слабоокрашенное.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №3 – контроль №2 – проверка блокировки эндогенной пероксидазной активности. Очень слабая окраска цитоплазмы и ядра. Блокировка эндогенной пероксидазной активности произошла на 80%.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №5 – контроль №3 – проверка неспецифического связывания вторых антител, конъюгированных с пероксидазой, в клетках крови. Отсутствие неспецифического связывания на 80%.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №7 – ядро окрашено (не должно было окраситься), в цитоплазме не различаются мелкие и крупные гранулы (в мелких – ЛФ, в крупных – МПО); цитоплазма разорвана.

Рис. Иммуноцитохимия. Стекло №8 – ядро окрашено (не должно было окраситься), в цитоплазме не различаются мелкие и крупные гранулы (в мелких – ЛФ, в крупных – МПО); цитоплазма разорвана. Есть цельные клетки, в которых МПО вышла из азурофильных гранул, поэтому цитоплазма полностью окрашена.

Иммуноэлектрофорез (ракетный форез) Реактивы

• 0,1% Раствор агарозы на воде

• 2% Агаpоза на барбитал-трис-глициновом буфере рН 8,8

• Буфер для разведения проб: 0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4

• Электродный буфер: барбитал-трис-глициновый рН 8,8

• Буфер для пероксидазной реакции: 50 мМ трис-HCl, pH 7,4

• Реакционная смесь для МПО: 20 мг диаминобензидина (ДАБ), 30 мл 50 мМ трис-HCl буфера, pH 7,4 и 15 мкл Н₂О₂ 24% (готовится непосредственно перед использованием).

• 1 М хлорид натрия

• Кpаска для геля: 0,5% кумасси R-250, 10% уксусная к-та, 45% этанол

• Pаствоp для отмывания геля: 10% уксусная к-та, 45% этанол

Ход работы

• Чистые, сухие стекла погружали в 0,1% раствор агарозы на воде и аккуратно высушивали в вертикальном положении.

• На установленном горизонтально столике для заливки размещали стекла.

• 2% агарозу расплавляют и охлаждают до 45°С.

• Антитела к ЛФ и МПО растворяли в подогретом до 45°С буфере для разведения проб: 260 мкл сыворотки к ЛФ в 13 мл буфера и 200 мкл сыворотки к МПО в 10 мл буфера. Пеpед заливкой 2% агаpоза pазводится буфеpом с антителами в два раза до 1%: для разведенной сыворотки к ЛФ добавляли 13 мл 2% агарозы, а для сыворотки в МПО 10 мл 2 % агарозы

• Гоpячий раствор (45°С) 1% агарозы с антителами к ЛФ и МПО заливали по 3 мл на стекло. Толщина геля пpи этом получалась ~ 1-2 мм.

• В центре застывшем геле с помощью усеченного наконечника (или гребенки) формировали лунки.

• В лунки вносили исследуемые образцы и стандартные растворы антигена (0,5; 0,25; 0:125; 0:0625 мг/мл) по 10 мкл.

1. ЛФ 2. МПО

гель лунка1 лунка2 гель лунка1 лунка2

1 0,5 0,25 1 0,5 0,25

2 0,125 0,0625 2 0,125 0,0625

3 слезы слезы:2 3 экстр экстр:2

4 слюн слюн:2 4 0,5 0,25

5 экстр экстр:2 5 0,125 0,0625

• Стекла помещали на подложку, а затем в камеру для иммуноэлектрофореза.

Иммуноэлектрофорез шел в течение ночи при 20 мА.

• Стекла помещали в чашки Петри.