Приготовление хромосомных препаратов.

У человека берут небольшое количество клеток доступных и пригодных для цитогенетических исследований (клетки кожи – фибробласты, клетки костного мозга). Клетки костного мозга интенсивно делятся, но забор их затруднен. Фибробласты достаточно хорошо делятся в культуре, но культивирование занимает ≈ 18 – 20 дней.

В конце 50-х годов было обнаружено, что вытяжка из конских бобов способна стимулировать к делению клетки периферической крови. Действующее вещество вытяжки – фитогемагглютинин (ФГА).

Цельную периферическую кровь или выделенную лейкоцитарную массу помещают в питательную среду (199, RPM I, Игла) + ФГА, через 48 часов / 72 часа добавляют колхицин и через 2 часа клетки можно фиксировать. Перед фиксацией проводят гипотоническую обработку 0,56% раствором KCl. Проводится фиксация жидкостью Корнуа и рутинное окрашивание (азур – эозин или по Гимзе) или дифференциальное окрашивание.

В случае рутинного окрашивания все хромосомы окрашены одинаково и классификация их возможна только по группам (1961 г. в Денвере). В основу денверовской классификации легли величина хромосом и положение центромеры.

Денверовская классификация:

А – крупные метацетрические (1-3): крупные хромосомы с почти медианными центромерами в хромосомах 1 и 3, субмедианной цетромерой – 2. Эти 3 хромосомы хорошо отличаются друг от друга размерами и положением центромеры. Хромосома 1 содержит вторичную перетяжку в субцентромерном районе одного из плеч (более длинного).

В – крупные субметацентрические хромосомы с субтерминальными центромерами (4-5): хромосомы этих пар ни морфологически, ни размерами не различаются между собой. В редких случаях в хромосомах этой группы обнаруживается вторичная перетяжка в длинном плече вблизи центромеры.

С – средние субметацентрические (6-12,Х): хромосомы средних размеров с субмедианными центромерами, Х-хромосома сходна с самыми длинными хромосомами этой группы 6,7, от которых её трудно отличить. 6,7,8,11 и Х – более метацентричны; 9,10,12 – более субметацентричны. Хромосома 6 имеет вторичную перетяжку в середине короткого плеча. Хромосомы 8 и 9 содержат вторичную перетяжку в длинном плече вблизи центромеры.

D – крупные акроцентрические (13-15): хромосомы средних размеров с почти терминальными центромерами; все 3 пары являются потенциально спутничными, но не в каждой клетке и не у всех индивидуумов спутники обнаруживаются на всех хромосомах. Чаще всего спутники обнаруживаются на одной или двух парах. Между собой 3 пары хромосом морфологически неразличимы. Длинное плечо одной из этих хромосом имеет вторичную перетяжку вблизи центромеры.

Е – маленькие субметацентрические (16-18): довольно короткие хромосомы с почти медианным (16), субмедианным (17) и субтерминальным (18) центромерами. Хромосомы 16, 17 содержат в длинном плече вблизи центромеры вторичную перетяжку.

F – маленькие метацентрические (19-20): короткие хромосомы с почти медианными центромерами. Между собой неразличимы.

G – маленькие акроцентрические (21-22): очень короткие акроцентрические хромосомы. Обе пары хромосом потенциально спутничные, однако обычно лишь 2 хромосомы имеют на коротком плече хорошо выраженные спутники. На других хромосомах спутник выявляется реже. Между собой неразличимы.

У – хромосома: маленькая акроцентрическая хромосома; сходна по размерам и форме с 21 и 22 хромосомами, но не имеет спутников, отличается большей пикнотичностью и сближенными хроматидами длинного плеча, в середине длинного плеча имеет вторичную перетяжку.

Молекулярная биология.

Структура и методы анализа ДНК.

ДНК содержит информацию, необходимую для синтеза белка из АК. ДНК находится в клетках эукариот и прокариот.

ДНК – молекула, состоящая из 4 нуклеотидов: пуринов (А, Г) и пиримидинов (Ц, Т), которые соединяются в полинуклеотидную цепь, в которой чередуются остаток сахара (дезоксирибоза) и фосфат. Последовательность нуклеотидов ДНК (пар оснований) составляет информационную емкость молекулы, определяя порядок синтеза и АК последовательность белков в соответствии с 3-х буквенным (триплетным, универсальным) генетическим кодом.

ДНК представляет единственный тип молекул, способных к самовоспроизводству (репликации), что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах: от нескольких нуклеотидов до млрд. п.о.

В качестве единиц измерения размеров ДНК используют кило- и мегабары??????????????

Последовательности из 1000 и 1000000 п.о. ДНК может существовать как в виде однонитевых, так и в виде двунитевых молекул:

Двуцепочечные молекулы образуются в результате комплементарно соединенных между собой Г и Ц, А и Т. Водородные связи между парами нуклеотидов достаточно не прочны, поэтому цепи ДНК легко диссоциировать или разделить и также легко ассоциировать (соединить при изменении температуры или солевой концентрации). При каждом цикле ассоциации и диссоциации (отжиг – плавление) будет точно воспроизводиться двунитевая структура – дуплекс, устойчивость которой определяется соответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры представленные полностью комплиментарными нитями ДНК. Процесс образования дуплексов – гибридизация.

Способность к комплементарному взаимодействию оснований – одно из самых важных свойств ДНК, которое определяет возможность её саморепликации. Это свойство широко используют в молекулярной биологии для поиска и идентификации нужных последовательностей в молекуле ДНК с помощью специфических зондов – небольшие меченые фрагменты ДНК.

Нити ДНК:

1. кодирующая (смысловая)

2. комплементарная (антисмысловая)

Декодирование информации, заключенной в молекуле ДНК (транскрипция) осуществляется за счёт избирательного синтеза РНК, комплементарных определенным участкам ДНК, так называемых РНК – транскриптов.

Т.о., зная нуклеотидную последовательность кодирующего участка ДНК, можно однозначно прогнозировать АК последовательность, соответствующую полинуклеотидному фрагменту, тогда как одна и та же АК последовательность может кодироваться различным образом, при этом число возможных вариантов кодирующей ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.

Схема реализации потока информации:

ДНК → РНК → белок составляет основу молекулярной биологии.

Выделение ДНК, её синтез и рестрикция

ДНК может быть изолирована или выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра.

Этапы выделения ДНК:

1. быстрый лизис клеток

2. удаление с помощью центрифугирования клеточных органелл и мембран

3. ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа

4. концентрирование молекул ДНК путём преципитации в этаноле

Из 1 грамма ткани или 10⁹ клеток → 2 мг ДНК.

У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов или лимфоцитов. Для этого собирают 5 – 20 мл венозной крови, затем выделяют клетки специальным методом и разрушают клетки и ядерные мембраны, добавляя буферные растворы, которые содержат денатурирующие агенты. После разрушение мембран клеток добавляют протеиназу К/Е, затем проводят фенол – хлороформную экстракцию для разрушения белков, затем ДНК осаждают в этаноле (75^о), высушивают ДНК в течение суток и растворяют в специальном буферном растворе и в дистиллированной воде.

Оценку качества полученной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности в области белкового и нуклеинового спектра поглощения. В чистых образцах соотношении Е (260) / Е (280) > 1,8.

В противном случае процедуру очистки следует повторить, т.к. белки должны быть удалены. В процессе сложного и многообразного функционирования участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные, регулируемые и обратимые изменения. Эти модификации осуществляются с помощью ферментов (ДНК – полимераза, рестриктаза).

Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК – полимеразы. И в бактериальных клетках и клетках эукариот содержатся 3 различные формы ДНК – полимераз. Все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепь ДНК в направлении 5^/ - 3^/, последовательно присоединяя по 1 нуклеотиду к 3^/ - ОН концу, причем точность синтеза определяется комплементарностью. Т.о. для работы фермента ДНК – полимераза необходима однонитевая матричная ДНК с 3^/ - концом. Кроме того в середине ДНК должны присутствовать 4 типа dNTP (дезоксинуклеотид-3-фосфаты), сахар и 3 остатка фосфорной кислоты.

В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК – полимераза α, которая обладает различной активностью, в том числе и экзонуклеазной активностью в направлении 3^{/ -} 5^/. Это позволяет исправлять (репарировать те дефекты, которые были допущены при подборе комплементарных оснований). Экзонуклеазная активность используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов – НИК – трансляция.

Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), значительно расширились возможности генной инженерии.

In vivo рестриктазы участвуют в системе распознавания и защиты своих и чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 – 6, реже 8 – 12 нуклеотидов в 2-цепочечной молекуле ДНК и разрезают ДНК на фрагменты в местах локализации этих последовательностей (в сайтах рестрикции).

Количество образующихся рестрикционных молекул ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов – характером распределения сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции.

В настоящее время известно более 500 типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных типов бактерий и обозначают первыми 3 латинскими буквами видов бактерий.

В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают 3 класса рестриктаз:

• часто шипящие

• средне шипящие

• редко шипящие

Рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8 - 12 п.о.) являются редко шипящими, а узнающие короткие (4 – 5 п.о.) – часто шипящие.