Секвенирование последовательностей днк.

Следующим этапом анализа отобранного и клонированного ДНК – фрагмента является его физическое картирование и определение нуклеотидной последовательности, т.е. секвенирование.

Методология секвенирования достаточно проста и заключается в том, чтобы получить серию комплиментарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике однако определение нуклеотидной последовательности протяженных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую задачу.

Существуют 2 основных метода секвенирования:

• химическое (Максама-Гильберта) – используют химическое расщепление ДНК по одному основанию.

• дезоскисеквенирование (метод Сенджера) – синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании. Чаще при секвениронии используют метод Сенджера, т.к. он более надежен и прост в исполнении. На первом этапе ДНК денатурируют, получают однонитевые молекулы, затем секвенированный праймер (последовательность определенных нуклеотидов – искомая синтезированная олигонуклеотидная последовательность, которая комплиментарна определенному фрагменту ДНК исходной молекулы), создают условия для гибридизации праймера, т.е. образование двуцепочечного участка. Инициируют синтез ДНК, добавляют ДНК – полимеразу и dNTP, один из которых радиоактивный, синтез ведут в 4 параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических dNTP или терминаторов (ddNTP), при встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида, синтез ДНК прекращается. Т.о. в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивно меченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфичным для данной пробирки дезокситерминатора на конце молекулы ДНК. После электрофоретического разделения этих фрагментов на 4 соседних дорожках и радиоавтографии. Размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит определена и локализация дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК.

Популяционная генетика.

Определяет генетическую структуру популяций, которые в свою очередь определяются частотами браков, и факторами, влияющими на эти частоты генов.

ПОПУЛЯЦИЯ – это

основная единица в эволюционном ряду;

в генетике человека: группа людей, занимающих одну определенную территорию и свободно вступающих в брак.

ПАНМИКСИЯ – случайные свободные скрещивания.

ДЕМ – малая популяция (1500 – 4000 человек), характеризующаяся малым притоком лиц, происходящих из других групп, высокой частотой внутригрупповых браков и незначительным приростом населения (20% за 25 лет).

ИЗОЛЯТЫ – малые популяции (до 1500 человек), представители других групп не более 1%. Частота внутригрупповых браков более 90%. Прирост населения за 25 лет менее 20%.

Сибсы (сиблинии) – братья и сестры.

Человеческая популяция:

• численно возрастающая

• снижено давление естественного отбора

• для современных популяций характерно разрушение брачных изолятов

• все большая средовая гомогенизация, которая устраняет первичные причины расовых различий

• оздоровление среды, которая определяет полное генотипическое выражение признака

• замена одних форм болезней другими (сердечно-сосудистые и онкозаболевания вместо алиментарных и инфекционных)

Популяция человека с демографической точки зрения характеризуется следующими параметрами:

1. рождаемость

2. смертность

3. род занятий

4. возрастная структура

5. состояние экономики

6. географические и клинические условия

Генетическая структура характеризуется определенной системой браков, частотами генов и генотипов, и функции, нарушающие эти частоты.

Популяции являются достаточно стабильными и равновесными системами.

1908 г. – английский математик Харди и немецкий врач Вайнберг независимо друг от друга открыли закон равновесного состояния популяций:

• Относительные доли генотипов остаются в популяции неизменными из поколения в поколение при условии, что популяция бесконечно велика, панмиктична и в ней отсутствует вероятность мутаций.

• Популяция 1: АА = p

Популяция 2: аа = q

p + q = 1

AA x aa => AA = p²

2 AA x aa => Aa = 2pq

aa x aa => aa = q²

Таким образом в F₁ образуются соотношение генотипов p² : 2pq : q²

В F₂ :

Тип брака	Частота брака	Потомки
		АА	Аа	аа
АА х АА	p4	p4	-	-
АА х Аа	2(p2+2pq)=4p3q	2p3q	2p3q
АА х аа	2p2q2	-	4p2q2	-
А ах Аа	4p2q2	p2q2	2p2q2	p2q2
А ах аа	4pq3	-	2pq3	2pq3
аа х аа	q4	-	-	q4

AA = p⁴ + 2p³q + p²q² = p² (p² + 2pq + q²) = p²

Aa = 2p³q + 4p²q² + 2p²q² + 2pq³ = 2pq(p² + 2pq + q²) = 2pq

aa = p²q² + 2pq³ + q⁴ = q² (p² + 2pq + q²) = q²

(p +q)² = (p² + 2pq + q²) = 1

p – частота доминантного аллеля

q – частота рецессивного аллеля

p² – частота генотипов доминантных гомозигот

q² – частота генотипов рецессивных гомозигот

2pq – частота генотипов гетерозигот

Равновесие по одному аутосомному аллелю наступает через одно поколение и может сохраняться долгое время, если нет вмешательств в структуре популяции. Равновесие может устанавливаться по двум локусам, но это требует большего времени.

Закон Харди – Вайнберга применяют для анализа популяций с медико – генетической точки зрения, чтобы определить распространенность патологических генов, определить частоту гетерозигот (при появлении детей с рецессивной патологией), для проверки некоторых гипотез, выявить действующие на популяцию факторы естественного отбора.

Анализ популяции – определение частоты гена.Если трем генотипам соответствует три фенотипа, то определение частот аллелей проводится точно.

Фенотип Генотип

М L^M L^M

N L^N L^N

MN L^M L^N

Необходимо знать количество в популяции лиц с группами крови M, N, MN, чтобы узнать частоту генотипа М

Аналогично определяется частота аллеля N

Т.к. p+q=1, то Q_L^M = 1- P_L^M