Блот-гибридизация по Саузерленду (гибридизация in situ).

Одним из эффективных методов идентификации определенных участков ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является метод блот-гибридизации.

Суть метода: рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами. Образуются фрагменты ДНК разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (нитроцеллюлоидный фильтр, нейлоновая мембрана). Сам перенос – блотинг осуществляется за счет действия капиллярных сил или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченным ДНК или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Блот-гибридизация довольно высокочувствительный метод идентификации последовательности ДНК. При длительной экспозиции (несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК – зонда этот метод позволяет выявлять менее чем 0.1 мг ДНК.

При использовании зонда растворами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 100п.о. может быть выявлена в 10 мг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на авторадиографе после его экспозиции в течение 12 часов.

Метод позволяет работать с очень короткими олигонуклеотидными последовательностями (min 20 п.о.). Однако требуют хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра.

Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость этой процедуры делают метод дорогостоящим. Этот метод используется для диагностики генных заболеваний.

Сейчас иногда радиоактивные зонды заменяют зондами нитрата серебра. Гибридизация с меченным ДНК – зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот – гибридизации (зависит от конфигурации пятна на фильтре):

• округлое – дот – гибридизация

• продолговатое – слот – гибридизация

Методом гибридизации ДНК – зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название нозен – блот. Тогда как вестерн – блот или иммуноблот – это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с меченными АТ.

Для проведения гибридизации с ДНК – зондами не требуется предварительно выделить и очистить ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле и фильтрах, не только в растворе, но и на гистологических и хромосомных препаратах – гибридизация in situ.

Вариант метода, при котором в качестве зондов используют ДНК (РНК), меченные флюорохромами, называется FISH – фиш (флюоресцентная in situ гибридизация).

Меченый ДНК – зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации хромосом (денатурированные метафазные хромосомы). Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК.

Важное значение имеет подбор условий – после отмывки не связавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (например, радиоактивная метка) либо проведение соответствующей обработки – биотин, флюоресцин – меченые ДНК – зонды – места локализации последовательностей ДНК, комплиментарных используемому зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных жирных полос на соответствующем участке определенных хромосом.

Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения при определении не только хромосомной принадлежномти, но и внутрихромосомной локализации генов, когда имеются соответствующие ДНК – зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов.

Разрешающая способность FISH – до 50 тыс.п.о. (1/20 величины среднего хромосомного бэнда). Этот метод используют для тканеспечифичного распределения и внутриклеточной локализации мРНК.

ДНК – зонды, клонирование, векторные системы.

ДНК – зондом может служить любая однонитевая ДНК, ограниченного размера, используемая для поиска комплиментарных последовательностей в молекуле большого размера или среди пула разнообразных молекул ДНК.

В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные олигонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых не превышает 30 нуклеотидов. Зондами могут быть и выделенные последовательности ДНК из генома. Однако такие последовательности чаще всего клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.

Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулярную ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бактериальные клетки Коулина.

Химерные молекулы ДНК, составленные из фрагментов разного происхождения, носят название рекомбинантных ДНК.

В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро и аденовирусы и другие генетические конструкции.

Размеры клонируемых ДНК – зондов составляют сотни – тысячи нуклеотидов, что определяется способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов плазмидную ДНК.