Геномная и тканеспецифичная днк. Библиотеки генов, их скрининг.

Рассмотрим методы выделения и идентификации фрагментов ДНК, необходимых для анализа их использования в качестве ДНК – зондов.

Основным источником этих фрагментов является искусственным образом сконструированные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами, в зависимости от специфических особенностей этих последовательностей.

Библиотека генов – это полный набор клонированных перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выделенной из какого – либо материала.

В зависимости от происхождения ДНК различают:

• геномные библиотеки. Для конструирования геномных библиотек используют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, хромосом или из фрагментов хромосом. В геномных библиотеках присутствуют не только кодирующие последовательности генов, но также не смысловые внутригенные последовательности (интроны) и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некодирующих фрагментов ДНК значительно выше.

• библиотеки кДНК – генов – выделяют тотальную мРНК из тканей или культивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются интересующиеся исследователя гены. На следующем этапе методом обратной транскрипции синтезируют к ДНК. Полученную кДНК разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор. Библиотеки кДНК состоят из кодирующих (экзонных) областей генов.

Наиболее удобный размер встраиваемой ДНК сопоставим со средним размером гена млекопитающих (15-25 тыс.п.о.). Оптимальный по размеру набор перекрывающихся последовательностей геномной ДНК человека получается после её переваривания часто шипящими рестриктазами: Sau3a, M-bol. Информационная емкость каждой библиотеки (количество клонов) с различными встроенными ДНК определяется размерами исходного генома. Достаточно представительные геномные библиотеки млекопитающих содержат 8*10⁵ – 10⁶ различных клонов.

Часто библиотеки конструируют на основе фаговых или космидных векторов, в таком виде легче хранить большие количества химерных ДНК. Пакующая способность этих векторов 9 – 23 тыс.п.о. И эти векторы содержат удобные клонирующие сайты, что возможно для использования разных рестриктаз.

Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидами или любыми ДНК – зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрессионного вектора.

Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку высевают на плотнорастущих чашках Петри (газон бактерий), чтобы образовались отдельные литические бляшки, в результате инфицирования клеток одним рекомбинантным фагом. Все культуры дублируют путем отпечатка (реплика) на другие чашки Петри, затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие лизирующие колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре, затем блот – гибридизация с меченным ДНК – зондом.

После отмывки фильтров от несвязанных меченных зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локализации колоний, содержащих в фрагменте ДНК последовательности комплиментарные зонду или специфическому антигену. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят в тех местах, где произошло потемнение пленки, чтобы избежать возможного загрязнения, отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринированию.