3. Практическая часть.

1. Используя набор реактивов фирмы «Био-Ла-Тест» приготовить глюкозный реактив:

Содержимое одного флакона с реактивом 3 (буфер-хромоген) и одного с реактивом 4 (смесь ферментов: глюкозооксидаза, пероксидаза, аминофеназон) количественно растворить в 100 мл дистиллированной воды и перемешать. Реактив устойчив в течение 1 месяца при температуре (+2 – +8)ºС.

Раствор глюкозы готов к использованию.

Эталонный раствор содержит глюкозу 10 ммоль/л.

2. Лабораторная работа № 1. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови и моче глюкозооксидазным методом (используется набор «Био-Ла-Тест»).

ПРИНЦИП: глюкоза окисляется кислородом при каталитическом действии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода и глюконата. Возникшую перекись водорода определяют по реакции окислительного азосочетания производного фенола с 4-аминофеназоном, катализируемой пероксидазой.

глюкозооксидаза

Глюкоза + О₂ + Н₂О глюконовая кислота + Н₂О₂

пероксидаза

2Н₂О₂ + 4-аминофеназон + фенол квининомин + 4 Н₂О

Реактивы: 1) стандарт глюкозы – раствор 10 ммоль/л; 2) антикоагулянт – натрий хлористый, натрий ЭДТА, натрий фторид; 3) Буфер-хромоген – 4-хлор-3-метилфенол – 0,6 ммоль, NаК – фосфатный буфер, детергент; 4) смесь ферментов – глюкозооксидаза – 66,6 мккат, пероксидаза – 16,6 мккат, 4-аминофеназон – 0,7 ммоль.

Материал для исследования: сыворотка крови, моча.

Проведение анализа.

Длина волны (480 – 520) нм, кювета 1 см. Определение в сыворотке, плазме, моче.

Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении от 1 + 10 до 1 + 50 (результат умножают на разведение).

Отмерить, мл	Проба	Эталон	Контрольный раствор
1. Сыворотка, плазма, моча	0,01	-	-
2. Раствор глюкозы	-	0,01	-
3. Дистиллированная вода	-	-	0,01
4. Глюкозный реактив	3,0	3,0	3,0

Перемешивают и инкубируют 30 минут при 37ºС или 60 минут при комнатной температуре (+15 – +25)ºС. Раствор предохранять от действия прямого света! Измеряют оптическую плотность пробы (А₁) и эталона (А₂) против контрольного раствора. окраска стабильна не менее часа после инкубации.

РАСЧЕТ:

НОРМАЛЬНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ: 3,3 – 6,1 ммоль/л.

3. Проведение анализа с использованием набора реактивов «Ольвекс-диагностикум».

Состав набора:

5. реагент 1 – буфер;

6. реагент 2 – лиофилизат;

7. реагент 3 – калибратор 10 ммоль/л;

8. реагент 4 – кислота перхлорная.

Подготовка рабочих растворов.

Содержимое одного флакона № 2, аккуратно перемешивая, растворить в содержимом одного флакона № 1. Полученный рабочий реагент стабилен в течение 6 месяцев при температуре 2-8ºС. После использования флаконы плотно закрыть!