Радиобиология с основами радиоэкологии

Если их нет, возможности химического взаимодействия активированных радиацией атомов ограничены.

На третьей – химической стадии, завершающейся в течение первых 10–6–10–3 с после облучения, происходит взаимодействие ионов и радикалов, появляются вторичные свободные радикалы и перекиси, а также осуществляется взаимодействие всех этих продуктов с веществами и структурами клетки организма. Развитие молекулярных повреждений, приводящих к искажению обменных реакций, характеризует биохимический уровень радиационного повреждения, протекающий в течение времени, измеряемого долями секунды, минутами и даже часами. На второй и третьей стадиях в результате радиолиза воды, составляющей до 99% содержимого клетки, в присутствии кислорода возникают химически высокоактивные продукты – свободные радикалы Н., ОН., НО2., О.. Они могут непосредственно взаимодействовать с молекулами различных соединений, приводя их к окислению и инактивации.

Далее, на ранних этапах развития лучевого поражения происходит взаимодействие излучений с веществами клеток, приводящее к реализации поглощенной энергии, что определяет биологическое действие ионизирующего излучения, радиационное повреждение и гибель организма. Следует отметить, что ра- диационно-биологические процессы, протекающие в клетке на этом уровне организации живого, совершенно одинаковы как для животных, так и для растений и других организмов.

На клеточном уровне развития повреждения, реализующемся в течение первого клеточного цикла (10–24 ч), отмечаются нарушения в делении клеток, появление аберраций хромосом. И хотя эти процессы одинаково характерны для всех эукариотических клеток, ввиду особенностей строения растительной клетки и клетки животных они могут обладать определенной специфичностью.

Безусловно, наиболее четкие различия в биологическом дей­ ствии ионизирующих излучений на растения и животных проявляются при оценке их реакций на уровне организма. К настоящему времени радиобиологией накоплен достаточно большой фактический материал, свидетельствующий о разнооб­ разных­ реакциях живых организмов на действие радиации. Описаны всевозможные аномалии роста и развития различных организмов, морфологические изменения отдельных органов и организма в целом, нарушения различных физиологических и биохимических реакций, наследственные изменения, гибель и др. На ценотическом уровне могут возникать нарушения, происходящие в фитоценозе, биогеоценозе, которые являются самой последней стадией процесса поражения, приводящие к глобальным изменениям окружающей среды.

и может рассматриваться как общая закономерность прямого действия радиации на ферменты (рис. 6.3).

Непрямое, или косвенное действие­ излучения это такое, при котором молекула получает энергию, приводящую к ее из­ менениям при взаимодействии с другой молекулой либо продук­ тами, возникшими в результате прямого действия излучения. Косвенное действие ионизирующего излучения вызывает изменения молекул в растворе за счет продуктов разложения (радиолиза) воды, а не энергией излучения, поглощенной самими молекулами (рис. 6.4).

Согласно современным воззрениям, жизнь зародилась на Земле в ее теплых мелководных водоемах. Все живые организмы, включая и человека, в каждой клетке тела и межклеточных пространствах содержат воду с растворенными в ней солями. При воздействии радиации на живые системы любой степени сложности все начинается с элементарных актов ионизации и возбуждения молекул воды с образованием из них растворенного кислорода и его активных форм – радикалов и перекисей, обладающих повышенной окислительной активностью­. При косвенном действии ионизирующего излучения решающую роль играет радиолиз воды. Под термином радиолиз воды по-

торая диссоциирует с образованием двух радикалов Н и ОН – свободных радикалов.

Свободными радикалами называют ионы с неспаренными электронами, которые отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью. Время их жизни в воде не более 10–5 с, но за этот короткий период они способны рекомбинировать друг с другом или взаимодействовать с растворенным субстратом. Если в облучаемом растворе присутствует кислород, образуются и другие продукты радиолиза, обладающие высокими окислительными свойствами.

В гидрофобных (водоотталкивающих) органических структурах, главным образом жировых и жироподобных (липидных), ионизирующее излучение в присутствии кислорода вслед за ионизацией и возбуждением образует и другие продукты ра-

Важно учесть, что в присутствии кислорода высокоактивные окислительные радикалы образуются за счет радикалов – восстановителей Н. и е–гидр. Следовательно, в облученном водном растворе возникают благоприятные для окисления условия.

6. Радиационно-химические и радиационно-биохимические процессы... 175

6.3. Реакции радикалов органических молекул, ведущие к образованию стабильных продуктов

Свободные радикалы органических молекул в водных раст­ ворах вступают в основные типы реакций, к которым можно отнести:

1. Димеризация и присоединение

Продукты реакции – димеры молекул и агрегаты более высоких порядков. Например, при облучении водного раствора цистеина образует димер – цистин: R. + R. = R – R.

2. Реакции диспропорционирования

В результате реакции атом водорода перераспределяется между радикалами. Один из радикалов может восстановиться до исходной структуры, второй – превратиться в новое соединение. Например, при облучении раствора глицина в присутствии

перехватчиков ОН. и е– с аминокислотой взаимодействует ра-

. гидр

дикал Н , осуществляя отрыв атома водорода, образуя радикал глицина: R. + R. = RH + RC = CR.

3. Реакции гидролиза – взаимодействие с молекулой воды

Пример такой реакции – расщепление пептидной связи при облучении раствора белка.

. 4. Гидроперекисные превращения: R. + O2 = ROO. + RH = R + ROOH. Образование альдегидов, кетонов, спиртов. В облученных растворах обнаружено появление гидроперекисей аминокислот, тимина, цитозина. Если аминокислоты имеют длинные углеродные цепи, то образующиеся гидроперекиси весьма стабильны, как, например, гидроперекиси лейцина и изолейцина. В итоге гидроперекиси распадаются с образованием стабильных продуктов.

5. Реакции переноса водорода. В облученном водном раст­ воре восстановление органических радикалов может происходить за счет второго растворенного вещества R – Н, который отдает атом водорода: P + R – Н → R – H + P. Особенно эффективны соединения, содержащие свободные SH-группы. Результаты этих модельных опытов свидетельствуют о том, что низкомолекулярные молекулы-примеси, особенно содержащие SH-группы, репарируют повреждения макромолекул, возникающие в результате реакции с продуктами радиолиза воды.

Индуцированные свободными радикалами химические реакции вовлекают в этот процесс многие сотни и тысячи молекул, не затронутых излучением. В этом состоит специфика действия ионизирующего излучения на биологические объекты. Никакой другой вид энергии (тепловая, электрическая и др.), поглощенной биологическим объектом в том же количестве, не приводит к таким изменениям, какие вызывают ионизирующие излучения.

Биологический эффект облучения усиливается за счет кислорода, который всегда присутствует в среде и обладает сенсибилизирующим действием. В присутствии молекулярного кислорода в облученном растворе образуются окислительные радикалы НО2. и О2–. Важно учесть, что в присутствии кислорода высокоактивные окислительные радикалы образуются за счет радикалов-восстановителей Н. и е–гидр. Следовательно, в облученном водном растворе возникают условия, благоприятные для окисления. Свободные радикалы О2– и НО2. энергетически способны вызывать окисление органических веществ по любым связям, в том числе и тем, которые обычно устойчивы в ходе окислительно-восстановительных реакций.

6.4. Клеточные эффекты радиационно-химических реакций

В клетке организма в аналогичной ситуации процесс протекает значительно сложнее, чем при облучении воды, так как в реакцию вступают органические молекулы, которые повреждаются прямым действием радиации либо продуктами радиолиза воды. При этом возникают органические радикалы, обладающие также неспаренными электронами, являющиеся крайне реакционноспособными. Обладая большим количеством энергии, они легко могут привести к разрыву химических связей в жизненно важных макромолекулах (нуклеиновых кислотах, белках, ферментах, липидах). Чаще всего именно этот процесс происходит в промежутке между образованием ионных пар и формированием клеточных продуктов.

Процессы взаимодействия свободных радикалов и механизмы их возникновения изучает радиационная химия. Важно понять, что одни из этих процессов приводят к появлению биологически повреждающих продуктов, другие – к образованию непосредственно биологически опасных продуктов, третьи – к цепным реакциям. Большинство из этих реакций активизируется в присутствии растворенного кислорода. Например, существуют прямые доказательства того, что радикал ОН. участвует в процессе образования одиночных разрывов ДНК, хромосомных аберраций, гибели клеток бактерий и млекопитающих. Появление аномальных молекул ДНК приводит к синтезу измененных молекул РНК и белков. Эти новые молекулы, вовлекаясь в реакции метаболизма, могут приводить к его искажению, в результате чего возникают вышеописанные радиобиологические эффекты. Именно молекула ДНК является первичной мишенью как прямого, так и непрямого действия ионизирующих излучений.

Какие же реакции клеток возникают при действии ионизирующего излучения? Влияние ионизирующих излучений на клетки начало привлекать ученых уже вскоре после открытия

рентгеновских лучей и радиоактивного распада. Многочисленные исследования, выполненные на разных видах клеток, позволили уже в начале ХХ столетия сделать заключение, что любая живая клетка, будучи облучена достаточно высокой дозой, должна погибнуть. Помимо гибели облучение может вызывать различного рода морфо-физиологические изменения в самих облученных клетках и их потомках – от жировой дистрофии типа старческой дегенерации до наследуемых аномалий роста и развития. Немедленных морфологических изменений в клетках при высоких дозах облучения (до 1000 Р) не обнаружено; в зависимости от величины дозы они появляются на 2–3 сут. При этом в цитоплазме после облучения происходит изменение вязкости (при малых дозах – снижается, при больших – повышается); заметно просматривается вакуолизация цитоплазмы у клеток крови, красного костного мозга, паренхиматозных органов; повышается проницаемость мембран для электролитов и воды (из клетки выходит калий и накапливается натрий, у эритроцитов это приводит к гемолизу); повышается коэффициент лучевого преломления, связанного с денатурацией белков плазмы.

Одновременно могут происходить и другие прижизненные изменения цитоплазмы. Далее в облученных клетках наблюдается увеличение размеров и изменение формы ядер (гигантские ядра, тройные звезды в митозе, трех- и четырехядерные и гиперсегментированные клетки), возникают некротические явления – пикноз и редко лизис ядра. Подвижные клетки после облучения обычно принимают округлую форму. К прехо­ дящим клеточным реакциям или физиологическим, кумулятивным эффектам облучения, которые клетки легко переносят, следует отнести повреждение множественных структур клетки, нарушение метаболизма (ингибирование нуклеинового обмена, окислительного фосфорилирования). Они проявляются сразу после облучения.

Типичным примером преходящих лучевых реакций клеток является радиационная блокировака митозов, или задерж­ ка митоза. Еще на первом этапе развития радиобиологии было замечено, что количество делящихся клеток в популяции после облучения резко снижается. Именно тогда и возникла идея лучевого подавления развития опухолей. В настоящее время доказано, что время задержки митозов строго зависит от дозы облучения и этот эффект проявляется у всех клеток независимо от того, выживут они после облучения или погибнут. В опытах на синхронизированных культурах клеток получено, что задержка деления составляет примерно 1 ч на 1 Гр, причем с увеличением дозы облучения возрастает не доля реагирующих клеток, а величина реакции (продолжительность задержки деления) каждой облученной клетки. Из-за различий време-

ни задержки митозов восстановление митотической активности пула происходит волнообразно, так как любая делящаяся ткань представляет собой асинхронную клеточную популяцию. Динамика митотической активности клеток после облучения зависит от дозы и вида облучения. Вскоре после первичного падения митотический индекс резко повышается, затем снова снижается. Это начальное повышение – не истинное увеличение числа митозов, не возврат к норме, а одновременный митоз сильно- и слабозаторможенных клеток. Так образуется компенсаторная волна деления. Радиационная блокировка митозов является защитной реакцией клеток на облучение. Задержку митозов следует отличать от полного подавления митозов, когда клетка сохраняет жизнеспособность, но утрачивает способность к делению.

Летальные реакции клеток. В радиобиологии под клеточной гибелью понимают утрату клеткой способности к пролиферации, а выжившими называют клетки, которые после облучения сохранили способность к неограниченному делению (клонообразованию). Различают следующие типы (формы) клеточной гибели: интерфазная (интеркинетическая) гибель – до деления (под лучом) и без деления; митотическая (репродуктивная) гибель – после первого деления, в последующих делениях, гибель делящихся клеток популяции. Чем выше доза облучения, тем раньше гибнут клетки. Одной из форм клеточной гибели является слияние двух клеток и образование гигантской клетки. Такие клетки способны к двум-трем делениям до гибели, но они не жизнеспособны.

Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются различные повреждения ДНК и ее комплексов: одиночные и двойные разрывы (именно они ответственны за летальный исход облучения); повреждения азотистых оснований нуклеотидов с последующим их удалением из ДНК; внутри- и межмолекулярные сшивки типа ДНК–ДНК, ДНК–белок.

Экспериментальные доказательства определяющей роли ядра в клеточной радиочувствительности представлены в исследованиях Б.Л. Астаурова, использовавшего для этого феномен андрогенеза (мужского партеногенеза) – возможности развития организма из мужской зародышевой клетки без процесса оплодотворения на примере потомства тутового шелкопряда. Другим ярким примером экспериментов, доказывающих высокую радиочувствительность ядра, являются опыты И. Орда и К. Диниелли. В опытах на амебах с помощью микрохирургического метода они показали, что пересадка ядер особей, облученных в дозе 150 Гр, при которой выживает 5% клеток, вызывает примерно такой же летальный эффект (выживало 4% реципиентов). Если же облучению подвергали цитоплазму даже в дозе 250 Гр, после чего в нее трасплантировали необлученное ядро,

то эффекта не наблюдалось. Все 100% амеб делились и давали жизнеспособное потомство. Многочисленными экспериментальными данными доказано, что от степени облучения цитоплазмы зависят проявления и размеры ядерных нарушений, являющихся следствием сложных ядерно-цитоплазматических взаимоотношений в клетке.

6.5. Радиационно-химическое превращение молекул воды, роль кислорода в этих превращениях

Представление о косвенном действии излучения опиралось на существование трех явлений, которые, казалось, не находили объяснения с позиций теории прямого действия. Это – эф­ фект разведения, кислородный эффект и защитное действие

многих химических веществ, присутствующих в облучаемой среде наряду с объектом.

С позиций косвенного действия радиации эти особенности инактивации макромолекул в водных растворах объясняются тем, что все радикалы, возникающие при радиолизе воды, «разбираются» белковыми молекулами, и поэтому, естественно, что, независимо от общей концентрации белка число пораженных его молекул при данной дозе облучения всегда постоянно. Лишь при очень малой концентрации белка радикалы, не успев столкнуться с белковыми молекулами, рекомбинируют друг с другом, что уменьшает ионный выход.

При очень больших концентрациях белка ионный выход начинает возрастать за счет вклада прямого действия, при котором число инактивируемых молекул должно расти пропорционально концентрации. Это явление служит доказательством существования косвенного действия в модельных экспериментах. Именно такая зависимость наблюдается в экспериментах (рис. 6.6). На рис. 6.6 Б показано, как изменяется радиационнохимический выход пораженных молекул ДНК с увеличе-

Рис. 6.6. Количественные закономерности непрямого действия радиации в водных растворах:

А – зависимость числа инактивированных молекул карбоксипептидазы от концентрации раствора (В. Дэйл и др., 1949); Б – зависимость радиационно-химического выхода (G) однонитевых разрывов от концентрации ДНК (Дж. Коллинз и др., 1965).

нием концентрации раствора. Видно, что в широком диапазоне концентраций на каждые 100 эВ поглощенной энергии инактивируется одинаковое число молекул, т.е. радиационно-химиче- ский выход инактивированных молекул не зависит от концентрации. Таким образом, с увеличением концентрации раствора происходит снижение относительного числа инактивированных молекул. Этот эффект (его называют эффектом разведения или эффектом Дейла) используют для выявления непрямого действия радиации на молекулы. Для исследований механизма действия радиации на клеточном уровне, естественно, критерий «эффекта разведения» использован быть не может.

Поражающее действие излучения снижается с ростом ЛПЭ излучения, т.е. рентгеновские и g-лучи оказываются эффективнее a-частиц или ускоренных ядер элементов (рис. 6.7). Это связано с неодинаковой линейной плотностью ионизации, которая определяет пространственное распределение активных радикалов воды. В случае плотноионизирующего излучения продукты радиолиза пространственно не разобщены, значит, увеличивается вероятность их рекомбинации с образованием молекулярных продуктов Н2, Н2О и Н2О2. При действии редкоионизирующего излучения радикалы воды с большей вероятностью достигнут растворенных молекул и вызовут их поражение.

Под «кислородным эффектом» понимается усиление луче­ вого поражения при введении кислорода по сравнению с уров­ нем поражения при аэробном облучении.

Впервые это явление было описано К. Шварцем в 1909 г. Однако, детальные исследования роли кислорода в проявлении радиобиологических эффектов начались с 1950 гг. А. Дауди и сотр. (1950) показали, что в условиях гипоксии имеет место увеличение выживаемости летально облученных рентгеновскими лучами крыс (табл. 6.1). Как

Рис. 6.7. Зависимость кислородного эффекта от вида ионизирующих излучений:

А – рентгеновское излучение; Б – нейтроны с энергией 15 МэВ; В – a-излучение (Дж. Ба-

рендсен и др., 1966, 1967).