Петровский Б.В., Перельман М.И. - Аутотрансплантация лёгкого в эксперименте

80 Глава третья

так как он является наиболее простым тестом для оценки функци­ ональной целостности афферентных нервных волокон блуждающе­ го нерва. Для исследования рефлекса Геринга — Брейера приме­

рефлексы на вдыхание путем создания положительного давления на колокол бронхоспирографа. При этом оказалось, что интактное легкое реагирует на увеличение груза уменьшением частоты дыха­ ния, а при значительном увеличении груза паступает задержка дыхания до 1 минуты. W. L. Secrist et al. (1967) получали реф­ лекс Геринга — Брейера путем вдувания воздуха в легкое под давлением 20 см вод. ст. при бронхоспирометрии. Наиболее физи­ ологичным методом изучения рефлекса Геринга — Брейера в на­ стоящее время является методика кратковременного отключения бронха на высоте вдоха.

Рефлекс Геринга—Брейера воспроизводят под поверхностным внутримышечным морфин-тиопенталовым наркозом при интуба­ ции бронхов двупросветной трубкой. Вначале осуществляют бронхосппрографию с отключением противоположного (интактного) и аутотрансплантированного легких. Бронхоспирография позволя­ ет окончательно убедиться в правильном положении интубационной трубки с полным разобщением главных бронхов и герметизмом системы.

На высоте вдоха производят кратковременное отключение лег­ кого путем пережатия одного из каналов интубацпонной трубки (на время, соответствующее одному вдоху и выдоху). В результа­ те возникает тормозной рефлекс Геринга — Брейера, выражаю­ щийся в остановке дыхания противоположного легкого на вдохе. Механизм рефлекса следующий: происходит раздражение аффе­ рентных волокон блуждающего нерва, возникает импульс, который поступает в дыхательный центр, и рефлекторная дуга по диафрагмальному нерву заканчивается в диафрагме, вызывая ее расслаб­ ление, что обусловливает прекращение дыхания на один вдох, пос­ ле чего следует выдох. Если при кратковременном отключении легкого остановка дыхания не возникает или происходит лишь бо­ лее глубокий выдох, то это означает, что рефлекс Геринга — Брейе­ ра отсутствует. Обычно во время бронхоспирографии производят несколько повторных исследований у одного и того же живот­ ного.

Исследование насыщения крови кислородом и кислотно-ще­ лочного состояния. Взятие крови для исследования проводят без применения жгута и без предварительного введения наркотиче-

82 Глава третья

крови 02 производят кюветным способом на отечественном оксигемометре модели 0-38 завода «Красногвардеец».

На основании полученных показателей насыщения кислоро­ дом артериальной (НЬОгА) и венозной (НЬ02 В) крови вычисляют артерио-венозное различие по 02 (А — В).

При исследовании кислотно-щелочного состояния крови опре­ деляют с помощью микро-рН-метра Аструпа фирмы «Радиометр» (Дания) следующие показатели: концентрацию водородных ио­ нов (рН), парциальное давление углекислоты (рС02 ), стандарт­ ные бикарбонаты (SB), избыток оснований (BE) по принятым методикам (Агапов, 1968).

ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

Состояние системы свертывания крови оценивалось по следу­ ющим показателям: время свертывания крови по Ли-Уайту; время рекальцификации плазмы по методу Хорна, а также по Бергергоффу и Рока; протромбиновое время по Квику; тромбиновое время по Перлику; толерантность плазмы к гепарину по Гормсену; вре­ мя свободного гепарина по Сирмаи; определение фибриногена и фибринолитической активности по методу Бидвелла в модифика­ ции Г. В. Андреенко; тромбоэластография на аппарате Хартерта.

Мы применяли тромбоэластографический метод анализа актив­ ности первой, второй и третьей фаз свертывания крови по Хартеру, а также оценку максимальной амплитуды тромбоэластограммы и лизиса структуры сгустка по Г. А. Якунину и Г. Б. Волковойнову. Об общей тенденции изменений свертывания крови судили по тромбоэластографическому показателю ( г + К ) , который характеризу­ ет три фазы свертывания крови (Филатов, Котовщикова, 1963).

Взятие крови для исследования производят перед операцией (из бедренной артерии). Во время аутотрансплантации левого лег­ кого взятие крови осуществляют путем пункции левого предсер­ дия в следующие моменты: после мобилизации элементов корня легкого, через 5 минут после внутривенного введения гепарина и к концу операции, перед зашиванием грудной клетки.

В опытах с аутотрансплантацией нижней доли левого легкого при удалении верхней и сердечной долей взятие крови произво­ дят путем пункции легочной артерии и нижней легочной вены до и после аутотрансплантации доли.

84 Глава третья

Проведено ферменто-гистохимическое изучение аутотрансплантированного легкого до и после консервации различной продолжи­ тельности в случаях отсроченной аутотрансплантацни.

Для определения активности ферментов применяли питротетразолий синий, который давал окрашенный нерастворимый осадок диформазана в местах наибольшей активности ферментов (Пирс, 1962). Срезы приготовляли в криостате.

Исследовали активность и локализацию окислительно-восста­ новительных ферментов, имеющих отношение к циклу Кребса

татдегидрогепазы; а-глицерофосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы; к функции пептозного цикла — глюкозо-6-фосфатдегид- рогеназы, а также неспецпфическпе фосфатазы — щелочную и кислую.

В аутотрансплантированном легком определяли также актив­ ность неспецифических эстераз, гидролизующих а-нафтилацетат, и липаз, гидролизирующих Твин-60 (Берстон, 1965; Пирс, 1962).

Активность и локализацию ферментов исследовали в эпителии бронхов, эпителии слизистых желез, мышечных пучках бронхов, в клеточных элементах стенки бронхов, альвеолярных перегоро­ док и в альвеолярных макрофагах.

Легкое удаляли сразу же после введения собаке внутримышечно с целью релаксации листенона из расчета 50 мг на 1 кг веса. Затем легкое промывали ледяным раствором 0,9%-ного КС1 и хранили при температуре +2 ±1° в мар­ ле, смоченной КС1. Митохондрии из ткани легкого выделяли по методике Reiss с небольшими изменениями. 7 г измельченной ткани легкого гомогени­ зировали в 60 мл среды выделения, содержащей 0,25 М сахарозу, 0,01 М трисбуфер и 0,001 М версена; рН 7,4. Гомогенат фильтровали через капрон. Для осаждения ядер и клеточных оболочек гомогенат центрифугировали 3 ми­ нуты при 750 g. Для выделения митохондрий супернатант центрифугировали 8 минут при 20000 g. Митохондрии из 7 г ткани суспендировали в 0,5 мл сре­ ды, содержащей 0,3 М сахарозу и 0,02 М трис-буфер. Среда инкубации состоя­ ла из 0,01 М КН2Р04, 0,01 MgCl2, 0,007 M KC1, 0,24 М сахарозы, 0,64 мМ АТФ. Субстратом окисления была 0,01 М янтарная кислота. В полярографическую ячейку, содержащую 1 мл инкубационной среды при температуре 26°, вво­ дили 0,06 мл суспензии митохондрий.

Скорость потребления кислорода суспензией митохондрий ре­ гистрировали полярографически, с помощью закрытого тонкой ре­ зиновой пленкой платинового электрода кларковского типа. Ско-

рости потребления кислорода митохондриями ткани легкого изме­ ряли в разных метаболических состояниях: втором (дыхание в среде с субстратом окисления — сукцинатом), третьем (дыхание в среде с субстратом окисления и акцептором фосфата-АДФ), четвертом (дыхание после превращения добавленной АДФ в АТФ) и при разобщении окисления фосфорилирования 2,4-ди- нитрофенолом.

Электронно-микроскопические исследования проводили после консервации легкого с отсроченной аутотрансплантацпей. С этой целью кусочки легкого фиксировали в 2,5% -ном глютаральдегиде с последующей дофиксацией раствором четырехокиси осмия на фосфатном буфере (по Миллонигу). После обезвоживания в серии спиртов ткань заключали в эпоксидную смолу (Эпон 812). Срезы получали на ультратоме типа LKB-8000, докрашивали нитратом свинца (по Рейнольдсу) и просматривали под электронным мик­ роскопом типа JEM-7A при ускоряющем напряжении 80 кв.

Активность сурфактанта в аутотрансплантированном легком до

пинцетом в капле воздухонасыщенной воды на покровном стекле. Пузырьки, выделенные из кусочка легкого, рассматривали в вися­

20 минут эти пузырьки исчезали, отчасти уменьшались или оста­ вались неизменными в размере, а затем становились устойчивы­ ми. Подсчитывали отношение конечной площади поверхности пузырьков к начальной, которое называется показателем стабиль­ ности (ПС) пузырьков. Этот показатель отражал содержание сур­

При статистической обработке материалов применяли методы, опубликованные в известных руководствах по медицинской стати­ стике (Хилл, 1958; Ойвин, 1960; Венчиков, 1963; Каминский, 1964). Вычисления произведены на электронно-вычислительной машине «Наири».

Глава четвертая РЕЗУЛЬТАТЫ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ

ЛЕГКОГО ИЛИ ДОЛИ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЗУЛЬТАТОВ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ ЛЕГКОГО ИЛИ ДОЛИ

Аутотрансплантация легкого или доли была произведена в 260 опытах. Операции выполняли на взрослых беспородных собаках (средний возраст от 2 до 5 лет), вес животных колебался в преде­ лах от 7 до 26 кг. Средний вес животных, использованных в опы­ тах, был равен 18 кг (М ± га =18,0 ± 0,33 кг). Из 260 собак было 174 самца и 86 самок. В 248 опытах операции были выполнены сле­ ва, в 12 — справа.

При проведении экспериментов специальный отбор животных не осуществлялся. Однако на основании нашего опыта лучше пере­ носили операцию крепкие животные с хорошо развитой мускула­ турой, широкогрудые, в возрасте 2—5 лет, весом от 17 до 22 кг. В экспериментах предпочитали использовать молодых животных, ко­ торые лучше переносили операцию, при благоприятном исходе могли наблюдаться в течение длительного времени и при необхо­ димости могли быть оперированы на противоположном легком; са­ мок изучали также в условиях значительных физиологических на­ грузок при беременности и родах.

Весь экспериментальный материал по аутотрансплантацпи легкого и его доли разделен на три группы в зависимости от вида операции. В I группу включены 73 эксперимента по аутотранс­ плантацпи левого легкого, во II группу — эксперименты по ауто­ трансплантацпи нижней доли левого легкого (16 опытов) и ауто­ трансплантацпи нижней доли левого легкого при удалении верхней

пической аутотрансплантацпи нижней доли правого легкого в ле­

операции осуществлялись одномоментно путем двусторонних по­ следовательных торакотомий.

Все эксперименты с целью более детального изучения проана­ лизированы по трем периодам после операции: ранний послеопе­ рационный период — до 14 дней, ближайший — от 15 до 60 дней и отдаленный — свыше 2 месяцев. Это разделение было необходимо

* 2 собаки погибли от причин, не связанных с операцией.

2 Как известно, обе плевральные полости у собак разделены нежной,

тонкой перегородкой, состоящей из двух листков плевры, легко подвижной и ранимой во время операции. Поэтому наиболее часто пневмоюракс с коллапсом легких был причиной смерти при разра­ ботке нового вида операции — гетеротопической аутотранспланта­ ции доли легкого из одной плевральной полости в другую (16 на-

блюдений из 25). Малейшее нарушение герметизма ткани легкого, анастомоза бронха или грудной стенки в послеоперационном пери­ оде приводило к гибели животных.

Одной из сравнительно частых причин смерти животных был отек легких (11,2%). В основном отек легких был причиной смерти животных после отсроченной аутотрансплантации легкого с кон-