n1

Перенос рекомбінантної ДНК у клітину хазяїна, клонування генів і їх відбір

Описана вище процедура складна й дозволяє отримувати лише зовсім незначні кількості рекомбінантної ДНК. Клонування – це спосіб її накопичення. Поняття «клон» визначається як велика популяція іде- нтичних молекул, бактерій або клітин-нащадків одного предка.

Після одержання химерних плазмід їх вносять у середовище, де зна- ходяться клітини хазяїна, у даному випадку кишкової палички. За певних умов вони включаються в бактеріальні клітини й утворюється рекомбі- нантна бактерія. Процес введення плазміди в клітину, яка спричиняє в ній спадкові зміни, називається трансформацією. Ефективність проник- нення ендогенної ДНК у клітину низька. Для поліпшення проникнення рекомбінантної ДНК плазміди в клітину їх обробляють різноманітними способами, наприклад розчинами солей кальцію хлориду, після чого мембраниклітинстаютьпроникнимидлярекомбінантнихДНК.

У клітині плазміди починають розмножуватися (реплікуватися). Після розмноження новоутворені бактеріальні клітини також містять рекомбінантні плазміди. Далі вирощують колонію клітин кишкової па- лички у ферментерах з великими об'ємами на свіжому поживному сере- довищі, збільшуючи кількість рекомбінантних плазміддо 1012.

При використанні великої кількості бактеріальних клонів, які несуть випадкові фрагменти ДНК, потрібний ген обов'язково знахо- диться на якомусь клоні, який виявляється різними методами. На- приклад, за біологічною активністю одержаного продукту: якщо це фермент, то він ідентифікується за участю в метаболізмі певних ре- човин, якщо інтерферон – за противірусною активністю, інсулін – за гормональною активністю і т.ін. Проте найзагальнішими методами є імунологічний аналіз, який застосовується як у випадку прямої екс- пресії, так і при синтезі рекомбінантних ДНК, а також гібридизація із синтетичним нуклеотидом, міченим 32Р.

Останній етап у роботах з генетичної інженерії – адаптація вве- деного гена в іншому для нього генетичному та фізіологічному ото- ченні і його експресія, тобто синтез специфічного білка. Бактерії із вбудованим чужим геном, які діляться, синтезують окрім своїх білків і білок вбудованого гена. Завдання виробництва полягає у виділенні та очищенні отриманого білка.

При введенні ДНК еукаріотів у геном бактеріальної клітини виникає ряд труднощів. Щоб забезпечити транскрипцію вбудова- ного гена часто перед ним на ділянці ДНК плазміди розташову- ють високоефективний промотор або використовують метод злиття генів. При цьому утворюються об'єднані поліпептиди. По- тім їх розділяють. Таким чином, наприклад, був отриманий гор- мон соматостатин (див. вище).

Клонування генів інтерферону

Інтерферон – білок, який належить до класу глобулінів, які син- тезуються в лейкоцитах людини. Одержаний у чистому вигляді, він використовується як фармпрепарат для лікування вірусних захворю- вань, наприклад, грипу, а також деяких злоякісних пухлин.

421

На першому етапі з донорської крові виділяють лейкоцити, зда- тні синтезувати інтерферон. Потім з одержаних лейкоцитів виділя- ють індивідуальну інтерферонову мРНК, яку гібридизують із ДНК- затравкою для подальшого синтезу ДНК:

Процес гібридизації полягає в утворенні подвійної спіралі, складе- ної з мРНК і ДНК-затравки, побудованої за правилом комплементар- ності. Використовуючи фермент РНК-залежну ДНК-полімеразу або ре- вертазу, здатну здійснювати синтез ДНК на матриці мРНК (зворотна транскрипція), синтезуютьповнугібридну молекулумРНК-ДНК.

Потім за допомогою специфічних РНКаз вилучається мРНК. Піс- ля цієї процедури залишається одноланцюгова ДНК. За допомогою ферменту ДНК-полімерази по однонитковій матриці синтезують на- ступний ланцюг ДНК. Утворена молекула є геном інтерферону.

Одержання інтерферону генноінженерним способом можна зо- бразити в загальному вигляді:

422

Колонії, які містять плазміди із вбудованою ДНК, відбирають шляхом гібридизації із синтетичним олігонуклеотидом, міченим 32Р. Потім, використовуючи ряд методів генної інженерії й молекулярної біології, одержують ген інтерферону. Щоб створити умови для здій- снення експресії гена інтерферону в клітинах кишкової палички, його забезпечують регуляторними елементами транскрипції і трансляції.

Застосування клонованих генів

Уже клоновано гени ряду інших білків, які застосовуються в ме- дицині. Необхідний для лікування цукрового діабету гормон інсулін звичайно одержують із підшлункових залоз забійної худоби. Інсулін свиней і великої рогатої худоби відрізняється за своїм амінокислот- ним складом від людського, і тому для деяких хворих він неефекти- вний і навіть дає алергічну реакцію. Недавно вдалося примусити ки- шкову паличку синтезувати людський інсулін, який тепер уже засто- совується для лікування діабету. Стало можливим використання в лі- кувальній практиці гормону росту (соматотропіну).

Генна інженерія відкрила нові можливості для одержання білко- вих вакцин (білки вірусу гепатиту В) і білкових препаратів з діагнос- тичною метою (СНІД та ін.).

На сьогодні вироблено стратегію вивчення молекулярної при- роди ряду захворювань – таких, як спадкова гіперхолестеролемія, таласемія, серпоподібно-клітинна анемія, муковісцидози та ін.

У клітинах, які несуть відповідні клоновані гени, можна з висо- ким виходом одержувати велику кількість різноманітних білків, які використовуються в медицині, сільському господарстві. Під керів- ництвом В.Г.Дебабова вперше у світі було створено промисловий штам мікроорганізмів, які синтезують у великій кількості незамінну амінокислоту – треонін.

У роботах з генетичної інженерії брали участь і вітчизняні вчені: О.О.Баєв, Ю.А.Овчинников, Е.Д.Свердлов, Г.П.Георгієв, М.М.Коло- сов та ін.

Клонування в різних організмах

В останні роки зроблено спроби використання в генній інженерії нових векторів, у тому числі рекомбінантних (подвійних), що забез- печують інтеграцію чужорідного фрагмента ДНК безпосередньо в хромосому хазяїна. Проводяться дослідження з використання еука- ріотичних векторів, наприклад, плазмід нижчих еукаріотів-дріжджів.

На сьогодні розроблені системи клонування в різноманітних ба- ктеріях, рослинах та клітинах ссавців. Клонування в бактеріях вико- ристовується в промисловості для багатьох цілей, у тому числі й для одержання продуцентів антибіотиків.

Клонування в дріжджах. Застосовуючи прийоми, аналогічні при клонуванні в бактеріях, стає можливим синтез чужорідних білків у дріжджових клітинах. Трансформанти легко відбираються за їх здатністю давати колонії на збідненому поживному середовищі. Та- ким чином були одержані, наприклад, штами дріжджів, які секрету- ють інтерферон людини.

423

Клонування в клітинах тварин. Проблема клонування в клітинах тварин має велике значення для дослідження функціонування генів еукаріотів. Високий темп досліджень генної інженерії на клітинах тварин дозволяє сподіватись, що найближчим часом будуть розроб- лені простіші системи, які дозволять здійснити аналіз механізмів експресії (функціонування) генів еукаріотів і нададуть можливість створення організмів із заданими властивостями.

Генна інженерія рослин. Ця галузь ще недостатньо розвинена в порівнянні з генною інженерією мікробних клітин. На даний час вона заслуговує великої уваги, оскільки відкриває нові перспективи в рос- линництві. При наявності методів введення в рослинні клітини пев- них генів, здатних до функціонування і стабільної спадковості, від- криваються реальні можливості утворення рослин із попередньо за- даними ознаками. Для поліпшення властивостей сільськогосподар- ських рослин необхідно закласти у їх гени таку генетичну інформа- цію, яка б робила їх стійкими до засухи, заморозків, надавала б мож- ливість фіксувати азот і породжувала стійкість до сільськогосподар- ських шкідників. Це здійснюють завдяки переносу відповідних генів із рослин, які мають подібні властивості.

Проте необхідно відзначити, що перспективи розвитку генної інженерії вирішують не лише важливі теоретичні й практичні про- блеми, але й призводять до утворення таких типів ДНК, які можуть виявитися небезпечними для людини. Маніпуляції з різноманітни- ми геномами при подоланні міжвидових бар'єрів відкрили можли- вості для переміщення генів між організмами, які до цього практи- чно ніколи не контактували. Отож, завжди необхідно мати на увазі, що досліди з деякими генами можуть призвести до виникнення не- безпечних організмів з непередбаченою інфекційністю й негатив- ним впливом на екологію. Особливої обережності потребують ро- боти із вбудовування в рекомбінантні бактеріальні або вірусні мо- лекули ділянок ДНК онкогенних та інших вірусів тварин. Одна із серйозних небезпек полягає також у тому, що в цих роботах широко використовується кишкова паличка, яка населяє кишечник людини. Наприклад, якщо вирощений штам кишкової палички, що містить плазміду, в яку вбудовано геном патологічного для людини вірусу, надходить у кишечник людини, це може призвести до розповсю- дження даного захворювання, фармакокорекція якого практично неможлива. Отже, найважливішим питанням генної інженерії є, окрім оцінки потенційних переваг запропонованих дослідів, також зменшення їх потенційної небезпеки. З метою обговорення й запо- бігання можливим шкідливим наслідкам у 1975 р. була проведена міжнародна конференція із цього питання. Учасники конференції прийшли до згоди, що досліди з утворення рекомбінантних моле- кул ДНК повинні продовжуватися, але необхідно забезпечити біо- логічні й фізичні бар'єри, які б перешкоджали поширенню малови- вчених, ретельно не перевірених новоутворених організмів. Так, у до- слідах певної категорії дозволяється використовувати і створювати

424

тільки такі бактерії й плазміди, які не здатні виживати за межами лабораторій і, наприклад, гинуть при температурі вищою за +35°С,

тобто в організмі людини і т.ін.

Генна інженерія є одним із біохімічних методів біотехнології. Біотехнологія – це використання біологічних процесів з технологіч- ною метою. Принцип генної інженерії полягає в створенні гібридних молекул ДНК (тобто цілих молекул ДНК, утворених із фрагментів різних організмів), вбудовування таких молекул у геном різноманіт- них мікроорганізмів (які швидко діляться на живильному середови- щі) й одержання білка, відповідного структурі впровадженого гена. У даному випадку мікроорганізми синтезують поряд зі своїми біл- ками і білок вбудованого гена.

Перспективи, які відкриваються перед біологічною технологією з урахуванням останніх досягнень науки, важко переоцінити. В уза- гальненому вигляді їх переконливо визначив один із провідних у цій галузі знання вчених – академік О.О. Баєв: «Біотехнологію можна вважати сестрою механічної й хімічної технологій, поки ще скромну за своїми можливостями.

...Методи генетичної інженерії природно вписуються в біотех- нологію, розширюючи сферу застосування біотехнологічних процесів і стверджуючи реальність цього шляху. Бачаться майбутні шляхи розвитку генетичної інженерії в прикладній галузі, а також промис- лового використання рослинних і тваринних клітин. Усе це сприяти- ме остаточному утвердженню біотехнології як третього рівноправ- ного партнера в технологічному тріумвіраті».

425

ГЛАВА 12. ВІТАМІНИ

Необхідною умовою забезпечення нормальної життєдіяльності організму є вміст у харчовому раціоні людини, поряд із макрокомпо- нентами їжі – білками, жирами, вуглеводами, – так званих мікроком- понентів, або незамінних факторів їжі, до яких належать вітаміни.

Витоки вчення про вітаміни закладені в дослідженнях російського вченого Н.І.Луніна, який довів у 1880 р., що природні харчові продукти містять якісь додаткові термолабільні фактори, без яких організм не може нормально існувати. Саме це положення стало обґрунтуванням подальшого вивчення вітамінів й створення вітамінної теорії.

У практичному відношенні вперше використав вітаміни польсь- кий учений К.Функ (1911 р.), який і запропонував даний термін, що означає «аміни життя» (vita – життя, amin – амін, лат.). Функ устано- вив, що речовина, виділена з рисових висівок, яка виліковувала полі- неврит у голубів (В1 – авітаміноз), містить аміногрупу. З того часу термін вітаміни укорінився в біології та медицині, хоча в хімічній структурі багатьох із них відсутня аміногрупа і взагалі азот.

Отже, вітаміни – це необхідні для нормальної життєдіяльно- сті низькомолекулярні органічні речовини різноманітної хімічної природи, синтез яких у організмів даного виду відсутній або об- межений. Наука, що вивчає вітаміни, називається вітамінологією.

Усі вітаміни характеризуються наступними загальнобіологіч- ними властивостями:

1) біосинтез вітамінів відбувається переважно поза організ- мом людини і тварин, тому вони одержують вітаміни, головним чином, із їжею;

2)вітаміни не можуть бути для організму ні пластичним ма- теріалом, ні джерелом енергії;

3)вітаміни біологічно активні вже в малих кількостях і вкрай необхідні для всіх життєвих процесів;

4)недостатнє надходження в організм окремих вітамінів або порушення їх засвоєння спричиняє розвиток патологічних проце- сів у вигляді специфічних гіпо- і авітамінозів;

5)у підвищених дозах вітаміни можуть використовуватись з лі- кувальною метою як потужні неспецифічні фармакологічні засоби.

Існує умовний поділ вітамінних речовин на власне вітаміни і ві- таміноподібні речовини. Останні схожі за біологічними властивостя- ми на вітаміни, проте необхідні, як правило, в більших кількостях. На сьогоднішній день відомо близько 30 вітамінів і вітаміноподібних ре- човин, вивчена їх хімічна структура, властивості, здійснено синтез.

Номенклатура і класифікація вітамінів

До встановлення хімічної структури вітамінів їх позначали літера- ми латинського алфавіту з нижніми індексами, наприклад, вітамін А, В1, В2, С, Д і т.д. Сучасні назви вітамінів прийнято в1956 р. Комісією з номенклатури біохімічної секції Міжнародного союзу з чистої і прикла- дної хімії (IUPAC). Вони відображають хімічну природу або фізіологіч- ну дію, іноді з префіксом «анти», який вказує на здатність даного віта- мінузапобігати або усувати розвитоквідповідногозахворювання.

426

Окремі вітаміни являють собою групу близьких за хімічною структурою сполук. Ці варіанти одного і того ж вітаміну називають вітамерами. Вони виявляють майже однаковий специфічний біоло- гічний ефект, але відрізняються виразністю впливу на організм. Ві- тамери позначаються однією і тією ж літерою латинського алфавіту з різними цифровими індексами. Наприклад, відомі вітамери А1 й

А2, вітамери Д, Д1, Д2, Д3–Д7 та ін.

За фізико-хімічними властивостями усі вітаміни розподіля- ють на дві великі групи: 1) жиророзчинні і 2) водорозчинні. Жиро- розчинні вітаміни не розчиняються у воді і вилучаються із проду- ктів жировими розчинниками. До них відносять вітаміни А, Д, Е, К, F та ін. До групи водорозчинних вітамінів належать вітаміни В1, В2, В3, РР або В5, В6, Вс, В12, С та ін.

Сучасна класифікація, що базується на особливостях хімічної бу- дови вітамінів, дозволяє розділити їх на чотири основні класи: 1) ві- таміни аліфатичного ряду (С, В15 та ін.); 2) вітаміни гетероциклічної будови (В1, В2, РР, Е та ін.); 3) вітаміни ароматичного ряду (К, Р, ПАБК та ін.); 4) вітаміни аліциклічної будови (А, Д та ін.).

Порушення балансу вітамінів в організмі. Дисбаланс вітамінів

виявляється у формі нестачі (негативний баланс) та надлишку (позитивний баланс). Часткова нестача вітаміну називається гіпо- вітамінозом, а украй виражений дефіцит – авітамінозом. Нестачу одного вітаміну визначають як моногіповітаміноз, а відразу декі- лькох – як полігіповітаміноз.

Причини гіповітамінозів можуть бути екзогенними та ендогенни- ми. Екзогенною є, насамперед, аліментарна форма вітамінної недо- статності, обумовлена нераціональним харчуванням, неправильним зберіганням і неправильною кулінарною обробкою продуктів.

Іншою, не менше поширеною причиною екзогенних гіповітамі- нозів, є зміна складу нормальної кишкової флори (дисбактеріоз), яка спричиняється тривалим та безконтрольним застосуванням хіміоте- рапевтичних засобів (антибіотиків, сульфаніламідів та ін.).

Ендогенні (вторинні) гіпо- та авітамінози зумовлені такими причинами:

-частковим руйнуванням вітамінів у шлунково-кишковому трак- ті внаслідок зміни кислотоутворюючої функції шлунка (вітаміни В1, В5, С) або порушення утворення транспортних білків (В12);

-порушенням всмоктування і транспорту вітамінів, особливо на

тлі хронічних інфекційних запальних процесів у кишечнику. При не- достатньому надходженні у верхній відділ кишечника жовчі порушу- ється всмоктування жиророзчинних вітамінів;

- порушенням внутрішніх перетворень окремих вітамінів у біо- логічно активні і(або) коферментні форми, яке настає внаслідок окремих захворювань печінки чи генетично зумовлених дефектів апоферменту або ферментів синтезу коферментів;

- посиленням розпаду вітамінів в організмі в зв'язку з впли- вом факторів зовнішнього середовища, під час інфекційно- токсичних процесів тощо;

427

- фізіологічно високою потребою у вітамінах (організму, що росте, вагітних жінок).

Гіпервітаміноз або вітамінна інтоксикація – прояв позитивного дисбалансу вітамінів, який зумовлюється, як правило, їхнім надлиш- ковим надходженням в організм. Існує думка, що стан гіпервітаміно- зу більш характерний для тривалого прийому великих доз жиророз- чинних вітамінів, які характеризуються вираженою ліпофільністю і звідси – ймовірністю затримки в організмі. Для водорозчинних ві- тамінів більш характерною є гостра вітамінна інтоксикація, зумов- лена одноразовим введенням великої дози вітаміну.

Взаємодія вітамінів

Наявність взаємодії вітамінів на даний час вважається дове- деною. Встановлено, що кожний, окремо взятий вітамін, у процесі метаболізму не ізольований від впливу інших вітамінів, що, в ре- зультаті, позначається на кінцевому ефекті кожного з них.

Розрізняють такі основні прояви взаємодії вітамінів.

І. Вплив одного вітаміну на катаболізм іншого. Наприклад ві-

тамін Е, як антиоксидант, перешкоджає пероксидному окисленню вітамінів А і F, підвищуючи їхню біологічну активність.

Підтверджено, що вітамін В2 бере участь в обміні тіаміну, пан- тотенової кислоти, холіну, піридоксину, фолієвої кислоти. Установ- лено здатність вітаміну С зменшувати витрати вітамінів В1, В2, А, Е, фолієвої і пантотенової кислот, знижуючи потребу організму в них.

II. Вплив одного вітаміну на утворення коферментних форм ін-

шого, а звідси – на прояв біохімічної функції останнього. При цьому взаємодія одних вітамінів має синергетичний характер, а інших – ан- тагоністичний. Так, похідні вітаміну В2 входять до складу ферментів, які каталізують утворення із піридоксину піридоксальфосфату. Ко- баламін та аскорбінова кислота сприяють утворенню коферментної форми фолієвої кислоти.

Антагоністичні (негативні) взаємовідносини в утворенні кофе- рментних форм властиві тіаміну і піридоксину, які в процесі пере- творення в активні фосфорильовані похідні – ТДФ (ТПФ) та ПАЛФ – конкурують за АТФ. Нікотинамід, рибофлавін та пантоте- нова кислота конкурують між собою в реакціях сполучення з адені- ловою кислотою під час утворення коферментів-динуклеотидів.

III. Спільна участь вітамінів у єдиному біохімічному процесі. Про-

явицьоготипу взаємодій є найчисленнішими. Наприклад, відзначається спільна участь вітамінів А, В2, В6 і В5 в утворенні та регенерації родоп- сину, тобто в біохімічному акті зору. Фолієва та аскорбінова кислоти і, можливо, піридоксин беруть участь у біохімічному процесі, пов'язаному з проліферацією клітин крові. Цілий комплекс вітамінів (В1, В2, В3, РР, ліпоєва кислота) у сполученні з відповідними білками входять у струк- туру поліферментних комплексів піруватдегідрогенази та α-кетоглута- ратдегідрогенази, що забезпечують перетворення кетокислот в органі- змі. Ще одним класичним прикладом позитивної взаємодії є участь ас- корбінової кислоти і природних біофлавоноїдів (вітамін Р) в утворенні сполучної тканинита в регуляціїпроникності капілярів.

428

Наведені приклади свідчать про необхідність урахування взає- модії окремих вітамінів у разі сумісного їх застосування. З іншого боку, накопичений теоретичний матеріал став підгрунтям для ство- рення ефективних полівітамінних препаратів, номенклатура яких на сьогоднішній день становить понад 100 найменувань.

Антивітаміни

Антивітаміни – речовини різноманітної хімічної природи, які обмежують використання вітамінів в організмі і виявляють проти- лежну їм дію. Механізм дії антивітамінів у більш вузькому значенні трактується як антикоферментний. Це означає, що антивітаміни, як аналоги вітамінів, заміщують коферменти (похідні вітамінів) у фер- ментних системах, але не здатні виконувати їхньої функції. У цьому випадку антивітаміни є антиметаболітами.

Крім подібних за структурою, є ще речовини, головним чином біологічного походження, які, впливаючи на вітаміни, частково або повністю позбавляють їх біологічної активності. Це, наприклад, фе- рмент тіаміназа (руйнує молекулу тіаміну), аскорбіназа (руйнує ас- корбінову кислоту), білок авідин (зв'язує та інактивує біотин) та ін.

Антивітаміни використовують у медицині для лікування різних захворювань, у тому числі пухлинних, у разі бактеріальних інфекцій, а також для створення експериментальних авітамінозів (табл. 16).

429

Продовження табл. 16

430