n1

411

Принципи лікування і профілактики молекулярних захворювань

На сьогодні одним з ефективних методів лікування генетично обумовлених захворювань є дієта, яка передбачає виключення з раціо- ну тих продуктів, відносно яких хворий організм не має ферментів, які забезпечують їх перетворення; збагачення їжі речовинами, відсутніми в організмі, а також прийом речовин, у тому числі й фармакологічних засобів, знешкоджуючих токсичні продукти неповного метаболізму; заміщувальна терапія активним ферментом. Наприклад, при лікуван- ні фенілкетонурії призначається бідна на фенілаланін дієта; при гала- ктоземії – виключається харчова галактоза, а саме, молочні продукти, які містять лактозу. При порушенні синтезу, наприклад оротової кис- лоти – попередника піримідинів в організмі, збагачують їжу цитиди- ловою кислотою, що дозволяє обминути блок в обміні піримідинів і пом'якшити симптоми важкої мегалобластичної анемії. Вживаються заходи, спрямовані на зв'язування й виведення з організму накопиче- них токсичних продуктів метаболізму. Так, при захворюванні Вільсо- на-Коновалова, яке є наслідком дефекту білка, що переносить мідь – церулоплазміну, надлишок міді виводиться з організму завдяки вве- денню пеніциліну. Можливе також часткове «виправлення» патологі- чних білків шляхом їх модифікації. Хворим на серпоподібно-клітинну анемію вводять ціанат калію чи натрію, аспірин, цистеамін, які моди- фікують валін в 6-му положенні β-субодиниці HbS. Впровадження за- міщувальної терапії пов'язане із труднощами отримання й очистки ферментів, а також із методами їх доставки. На сьогодні розроблено спеціальні лікарські форми – ліпосоми (див. Біологічні мембрани), у які включають фермент. Використовують також трансплантацію тка- нин як джерела дефіцитних білків (інсулін, ферменти). Прийом окре- мих лікарських засобів може погіршувати перебіг ферментопатій, то- му при певних захворюваннях їх застосування є неможливим.

В останні роки були зроблені спроби лікування молекулярних хвороб шляхом пересадки нормального гена. Виявилося, що захво- рювання, спричинені функціональною нестачею продукту того чи іншого гена, можна усунути шляхом введення гена в організм. Стра- тегія підходу спрямована на клонування гена (див. нижче) у векторі, здатному включатись у геном клітини хазяїна. Дуже перспективним уявляється використання з цією метою попередників клітин кістко- вого мозку. Можна сподіватися, що такі клітини «приживуться» і бу- дуть розмножуватися, синтезуючи трансгенний продукт. Було зроб- лено спробу використання цього методу в клініці при лікуванні хво- рих на β-таласемію, пов'язану з дефектом синтезу β-субодиниць ге- моглобіну. Було пересаджено у клітини кісткового мозку ген, який несе інформацію про структуру ланцюга гемоглобіну. Метод дуже перспективний, проте не все ще вдається й не зовсім зрозумілі нас- лідки «поведінки» пересаджених генів і векторів у клітинах людини.

Профілактика молекулярних хвороб у значній мірі залежить від соціальних заходів: охорони навколишнього середовища від забруд-

412

нень, заборони використання отруюючих хімічних речовин, випробу- вання й використання радіоактивної зброї, ретельної перевірки хар- чових добавок і фармакологічних засобів на мутагенну активність, виконання правил техніки безпеки при роботі із джерелами іонізую- чого випромінювання і т.ін.

Рекомбінантні ДНК. Генна інженерія

Генетична рекомбінація – утворення зміненої хромосоми вна- слідок або нормального біологічного обміну генів, або об'єднання генів, одержаних з різних джерел, здатних після цього виявляти свої біологічні функції: брати участь у процесах реплікації, транскрипції, трансляції. При генетичній рекомбінації нова молекула ДНК утво- рюється шляхом розриву й об'єднання ланцюгів ДНК. У природі є рі- зноманітні форми переносу, обміну і змінення спадкової інформації, які служать джерелом утворення організмів із новими властивостями.

Велике наукове й прикладне значення має можливість експе- риментального керування переносом, обміном і зміненням гене- тичного матеріалу.

У останні роки особлива увага приділяється генетично рухомим елементам, які отримали назву «стрибаючих» генів, тобто таким ді- лянкам ДНК, які можуть зміщуватися з одних частин генома в інші. При цьому вони або залишають хромосому (втрачаються), або знову вбудовуються в її структуру або в іншу хромосому. Ці мігруючі елеме- нти беруть участь у регуляції дії генів та індукуванні хромосомних пе- ребудов. До них відносяться IS-елементи – інсерційні сегменти (від англ. insertion sequences), які складаються з 800–1500 нуклеотидних по- слідовностей, і транспозони (від англ. transpose – переміщувати) – складніші мігруючі елементи, які містять 3000–25000 нуклеотидних пар, часто з IS-елементами. Здатність мігруючих елементів у кількості від невеликих ділянок і до 5000–10000 нуклеотидних пар вбудовува- тись у різні ділянки ДНК за участю особливої ферментної системи, яка впізнає і пришиває транспозони на нове місце, зумовлена наявніс- тю на обох їхніх кінцях прямих або обернених (інсерційних) послідов- ностей основ нуклеотидів (типу АААА і ТТТТ або ААТТ і ТТАА).

Таким шляхом ген або набір генів може зміщуватися з місця на місце в межах однієї й тієї ж хромосоми, з плазміди або фага в бак- теріальну хромосому, або із плазміди у фаг. З’ясовані закономірності було використано при одержанні гібридних (рекомбінантних) ДНК. Виявилось, що гени з різних організмів можна штучно об'єднати й отримати нові рекомбінантні молекули ДНК, які можуть служити виключно цінним інструментом у генетичних дослідженнях, а також широко використовуватися із практичною метою.

Розвиток методів виділення генів, об'єднання їх у нових сполу- ченнях (гібридизація молекул ДНК), введення потім у клітини хазяї- на та їх клонування (накопичення) стало важливим біохімічним до- сягненням, яке відкрило нову еру в молекулярній біології. Перспек- тиви використання рекомбінантних ДНК сприяли виникненню ново- го напрямку в науці – генної інженерії.

413

Генна інженерія, або техніка рекомбінантних ДНК, включає су- купність прийомів, що дозволяють шляхом експериментальних опе- рацій in vitro перенести генетичний матеріал з одного організму (джерела генів) в інші (хазяїну або реципієнту) таким чином, щоб за- безпечити спадковість цих генів у новому для них організмі. Генна інженерія – це отримання живих організмів з попередньо заданими спадковими ознаками, з певним обміном речовин.

Засадами генетичної інженерії є універсальні властивості гене- тичного матеріалу, що дозволяє утворювати рекомбінантні молеку- ли ДНК з молекул ДНК різних організмів, наприклад, із клітин бак- терій і клітин еукаріотів і навпаки, вводити їх у живі клітини і вико- ристовувати з науковою і практичною метою. Наприклад, для одер- жання високопродуктивних штамів бактерій, які використовуються у мікробіологічній промисловості; підвищення врожайності рослин шляхом введення азотфіксуючих генів (що зумовить зменшення ви- користання добрив і поліпшення стану навколишнього середовища); промислового випуску незамінних амінокислот, пептидів і білків, у тому числі й лікарських препаратів. На даний час методи генетич- ної інженерії з успіхом використовують для одержання бактеріаль- них штамів – продуцентів біологічно активних сполук, у тому числі, – гормонів (інсуліну, гормону росту, соматостатину), противірусного препарату інтерферону та ін. Пряма пересадка генів у геном іншого організму дасть змогу виправляти спадкові дефекти. Такі результати одержані в експериментах на тваринах. Це відкриває перспективи радикального лікування спадкових захворювань шляхом одержання рекомбінантної ДНК, яка містить нормальний ген замість пошко- дженого, і введення її в геном хворого. Введення у звичайну нешкід- ливу бактерію генів, здатних окислювати вуглеводні нафти, може бути використано для очистки нафтових розливів.

Генна інженерія використовується і як спосіб отримання стабі- льних бактеріальних ферментів у значних кількостях.

В останні роки багато уваги приділяється питанням практич- ного використання рекомбінантних ДНК, однак не менше значення має й те, що клонування генів відкрило нові можливості для вирі- шення ряду фундаментальних проблем молекулярної генетики. Тепер з'явилася можливість виділяти й одержувати у великій кіль- кості фактично будь-який ген для того, щоб вивчити його нуклео- тидні послідовності, а також послідовності мРНК і білка, які коду- ються цим геном. Із розвитком генетичної інженерії стало можли- вим вивчення особливостей структури й функцій генетичного ма- теріалу еукаріотів. У першу чергу це стосується усвідомлення ролі різноманітних регуляторних і сигнальних ділянок ДНК, таких, як промотори, оператори та інші. Доступнішою стала також ідентифі- кація регуляторних механізмів, які здійснюють репресію й депре- сію специфічних генів еукаріотичних організмів.

У методах генної інженерії використовують такі операції:

1)отримання гена;

2)отримання гібридної (рекомбінантної) ДНК;

414

3)сполучення рекомбінантної ДНК із так званою векторною молекулою, яка здатна доставляти ген у клітину хазяїна і тим самим забезпечувати реплікацію чужорідного гена;

4)введення отриманої рекомбінантної ДНК у клітину хазяїна;

5)клонування рекомбінантної ДНК (рекомбінантних клітин);

6)відбір клітин, де розмножуються (клонуються) введені чужо-

рідні гени.

Отримання генів

Знаючи первинну структуру білка і його генетичний код, можна скласти послідовність нуклеотидів у гені заданого білка, а потім синтезувати його. У цей спосіб можна одержати невеликі гени до- вжиною до двох десятків кодонів. Перший ген було синтезовано у 1969 р. групою X.Корани. Ген аланінової тРНК дріжджів вони одер- жали шляхом сполучення синтетичних дрібних фрагментів (від 4 до 13 пар нуклеотидів) у необхідному порядку за допомогою ферменту ДНК-лігази. В одержаному гені бракувало регуляторних ділянок, тому він був функціонально неактивним. У 1976 р. X.Корана і спів- робітники синтезували фрагмент ДНК кишкової палички, який коду- вав тирозинову тРНК, але до його кінців вони приєднали гібридні затравки – тетрануклеотиди ААТТ і ТТАА. Синтезований ген ви- явився повністю активним. При введенні його в мутантний штам бактеріофага Т4, у котрому цього гена бракувало, бактеріофаг добре розмножувався в клітинах кишкової палички, тобто ставав повноцін- ним. Група Г.Бойера здійснила хімічний синтез гена гормону сома- тостатину і ввела його в лактозний оперон кишкової палички поруч із геном β-галактозидази (лактази) (див. Регуляція біосинтезу біл- ка). У результаті бактерія почала виробляти білок, у якому одна час- тина була β-галактозидазою, а друга – соматостатином. Отже, транскрипція і трансляція цього гібрида здійснювалася за рахунок використання відповідних регуляторних послідовностей β-галакто- зидази. Надалі соматостатин було виділено у вигляді пептиду. Ці блискучі експерименти показали можливість створення хімічним шляхом генів, які не відрізняються від природних.

У подальших дослідженнях із синтезу генів почали застосовува- ти менш трудоємкий і швидший метод – синтез за участю ферменту

зворотної транскриптази (ревертази). Цей фермент наявний у деяких РНК-вірусів, у яких генетична інформація зберігається не в ДНК, а в РНК (див. Види переносу генетичної інформації). При ви- вченні цього ферменту було з’ясовано, що матрицею для утворення ДНК може служити навіть синтетична мРНК. Це відкривало нові шляхи для синтезу різноманітних генів за матричною РНК. Якщо in vitro у спеціальну інкубаційну суміш додати певну мРНК (наприклад, мРНК проінсуліну), то синтезується ген, комплементарний саме цій мРНК, у якому закодована структура відповідного білка (проінсулі- ну). На мРНК ревертаза синтезує комплементарну їй ДНК-копію (кДНК). Тому роботу починають із виділення та очистки потрібної мРНК із суміші багатьох різних мРНК. Для цього використовуються

415

спеціалізовані клітини, які продукують переважно певний різновид білка. Наприклад, із ретикулоцитів – незрілих кров'яних клітин, у яких міститься багато гемоглобіну (90% від усіх білків), виділяють мРНК для одержання α- і β-поліпептидних ланцюгів гемоглобіну, з клітин інсуліноми – пухлини β-клітин підшлункової залози виділяють мРНК проінсуліну, із лейкоцитів – мРНК інтерферону і т.ін. Клітини руй- нують, збирають центрифугуванням рибосоми (полісоми), оброб- люють їх антитілами проти того білка, ген якого прагнуть здобути. Білок, який нас зацікавив, але ще прикріплений до полісом, що син- тезують його на матриці мРНК, взаємодіючи зі специфічними анти- тілами, випадає в осад. Специфічні мРНК, на яких синтезувався бі- лок, можна потім вилучити з осаду за допомогою хроматографічних методів практично в чистому вигляді, тобто без домішок інших мРНК. Тепер одержану специфічну мРНК використовують як мат- рицю для ферментативного синтезу кДНК за допомогою ревертази. Проте для функціонування ревертази необхідна затравочна ДНК. Як відомо, на 3′-кінці молекул мРНК вже є полі(А)-хвіст (див. Проце- синг пре-мРНК). Тому до мРНК добавляють полі(Т)-хвіст, який з полі(А)-хвостом утворює двохланцюгову ділянку, яка служить затра- вкою для ревертази (рис. 84). В утвореному гібриді мРНК-кДНК усу- вається ланцюг мРНК за допомогою ферментів РНКаз, і на однола- нцюговій кДНК за допомогою ДНК-полімерази I добудовується дру- гий ланцюг кДНК. У результаті утворюється дволанцюжкова кДНК, яка потім з'єднується з необхідним вектором (див. нижче).

Рис. 84. Конструювання дволанцюжкової кДНК на основі мРНК; *) – чотири види дезоксирибонуклеозидтрифосфатів

416

У лабораторіях різних країн у цей спосіб були синтезовані гени, які кодують білки людини, кроля, миші, гени вірусу осповакцини, де- яких бактеріофагів і т. ін. Однак необхідно враховувати, що при ви- користанні мРНК як матриця для синтезу ДНК утворюється не весь ген з регуляторними ділянками, а тільки його структурна інформа- ційна частина. Тому ще складнішим завданням є виділяти готовий ген з генома клітини. Це пов'язано з тим, що на частку кожного гена припадає лише невелика частина всього генома і, крім того, багато генів еукаріотів побудовані складно, іноді складаються з ряду окре- мих ділянок, розташованих на різних ділянках генома. Тому всю клі- тинну ДНК розщеплюють на фрагменти за допомогою обробки спе- ціальними ферментами – рестриктуючими ендонуклеазами (рестри- ктазами), багато з яких дають дволанцюжкові розриви тільки в об- межених ділянках ДНК з утворенням так званих «липких» або «ту- пих» кінців. Біологічна роль цих ферментів в організмі полягає в то- му, щоб розщеплювати чужорідні молекули ДНК, у той час як власна клітинна ДНК при цьому не розщеплюється, оскільки ділянки, що впізнаються своїми рестриктазами, в неї захищені (метильовані).

На сьогодні з різних видів бактерій уже виділено, вивчено і за- несено до картотеки за механізмом дії біля 200 різних рестриктаз; деякі з них широко застосовуються в генетичній інженерії. Рестри- ктази здійснили переворот в аналізі ДНК. Розщеплюючи ДНК на відносно невеликі фрагменти в чітко визначених місцях, вони відрі- зняються від більшості інших ферментів, хімічних або фізичних впливів, які спричинюють випадкові розриви ланцюгів ДНК. Тому рестриктази є незамінними інструментами для дослідження струк- тури хромосом, визначення послідовності нуклеотидів у дуже дов- гих молекулах ДНК, виділення генів і одержання нових гібридних ДНК. Важливого значення набуває той факт, що визначені рестри- ктази розпізнають специфічні послідовності нуклеотидів у ДНК до- вжиною від 4 до 6 пар основ і гідролізують фосфодиефірні зв'язки в обох ланцюгах у цій зоні. Якщо за допомогою рестриктаз два лан- цюги ДНК розщепити навскіс, то утворюються виступаючі, ком- плементарні одноланцюгові «липкі» кінці, а коли прямо – то «тупі» (див. нижче). При розщепленні однією й тією ж рестриктазою різ- них (двох) ДНК утворюються однакові «липкі» кінці й одержані фрагменти можуть комплементарно сполучатися між собою цими кінцями ДНК-лігазою за умови, якщо змішати ці ДНК, нагріти до 70°С і повільно охолоджувати. Таким чином утворюються нові ко- валентно зшиті рекомбінантні ДНК (рис. 85).

Різні ДНК можна з'єднати за допомогою ДНК-лігази й «тупими» кінцями, за участю ферменту – кінцевої нуклеотидилтрансферази. Цьому ферменту не потрібна матриця, тому він у змозі побудувати тільки 3′-кінцеві послідовності, складені з нуклеотидів одного типу, тобто до 3′-кінця одного фрагмента приєднується один гомополіну- клеотид, наприклад, полі(А), а до 3′- кінця другого фрагменту відпо- відно полі(Т). Оскільки такі послідовності комплементарні одна од- ній, то за допомогою їх можна сполучити дві ДНК. Об'єднати моле-

417

кули можна також сполученням їх кінців із синтетичними, так зва- ними «лінкерами». Звичайно як лінкери використовуються самоком- плементарні олігонуклеотиди довжиною 8–10 нуклеотидних залиш- ків, чутливі до розщеплення будь-якою рестриктазою.

Рис. 85. Схема розщеплення ДНК різними рестриктазами на фрагменти й утворення рекомбінантних молекул ДНКА і ДНКБ

Таким чином, існують, переважно, три способи сполучення мо- лекул ДНК: «липкі» кінці, гомополімерні кінцеві фрагменти і хімічно синтезовані лінкери.

Одержання рекомбінантних ДНК.

Конструювання вектора, який несе ген

Одержаний ген або фрагмент ДНК необхідно ввести в клітину таким чином, щоб він не був зруйнований клітинними нуклеазами і був би інтегрований у геном клітини. Для цього його in vitro з'єдну- ють із певною ДНК, яка виконує роль провідника (вектора). Век- тор – це молекула ДНК, яка може доставити в клітину хазяїна чужо- рідну ДНК будь-якого походження і цим забезпечити реплікацію чу- жого гена. Найчастіше для цього використовують бактеріофаги, ві- руси або плазміди бактерий – важливі рухомі генетичні елементи. Плазміди – невеликі дволанцюжкові кільцеві молекули ДНК, прису- тні в цитоплазмі багатьох видів бактерій. Переважно використову-

418

ють плазміди кишкової палички. Геном цієї бактерії представлений однією великою кільцевою хромосомою, локалізованою в ядерній зоні і прикріпленою до мембрани, і плазмідами, які «плавають» у ци- тозолі. Плазміда приблизно в тисячу разів менша за основну моле- кулу ДНК. У клітині звичайно міститься близько 20 копій дрібних плазмід і 1–2 великі. Їх можна легко виділити і відокремити від бак- теріальної хромосоми, від якої вони відрізняються розміром, щільні- стю, нуклеотидним складом. Реплікація плазмід відбувається неза- лежно від реплікації основного генетичного матеріалу, але одночас- но з нею. Деякі з них можуть вбудовуватись у хромосому і знову ві- докремлюватися від неї. Плазміди можуть переходити з однієї клі- тини бактерії в іншу при кон'югації клітин. Завдяки здатності до пе- реносу і до автономної реплікації плазміди широко використовують- ся в генетичній інженерії.

Для одержання рекомбінантної молекули ДНК (об'єднаної ДНК плазміди й ДНК фрагмента, який вбудовується) плазміди вилучають з кишкової палички, й обидва об'єкти гідролізують за участю рестриктаз одного виду. Кожен вид рестриктази позначається своїми символами, визначеними видом бактерії. Субстратна специфічність рестриктази, як уже зазначалося, виявляється в тому, що кожна з них впізнає певну нуклеотидну послідовність. Наприклад, рестриктаза типу EcoRI (з киш- кової палички) впізнає гексонуклеотидну послідовність у двох ланцю- гах ДНК і розрізає її в зазначених стрілками точках:

Відбувається гідроліз зв'язків між нуклеотидами Г і А. Ділянки розщеплення являють собою паліндроми або обернені повтори (із грецької palindrome – перекручений), тобто послідовності, які по- вторюються в зворотному порядку. EcoRI-рестриктаза розщеплює два ланцюги ДНК у різних точках, тому продукти розщеплення мають «липкі» кінці. Другий вид рестриктази (наприклад, HpaІ) впізнає послідовності:

Розщеплення відбувається між нуклеотидами Т і А в однакових точках, отже, продукти розщеплення мають «тупі» кінці.

Використовуючи рестриктазу однієї специфічності, розрізають як ДНК плазміди, так і ДНК обраного для пересадки фрагмента, у результаті чого утворюються, наприклад, «липкі» кінці. Якщо те- пер змішати оброблені фрагмент ДНК і плазміди, то вони сполучатимуться між собою «липкими» кінцями (рис. 86). Потім за допомогою ферменту ДНК-лігази утворюються фосфодиефірні

419

зв'язки між кінцевими неспареними нуклеотидами обох молекул і знову отримують кільцеву молекулу ДНК плазміди, але тепер вона разом із плазмідною ДНК містить чужорідний фрагмент ДНК, об- раний для пересадки, тобто утворюється рекомбінантна ДНК або рекомбінантна плазміда. Іноді здійснюють сполучення ДНК плаз- міди й фрагмента тупими кінцями, використовуючи фермент нук- леотидилтрансферазу з утворенням гомополінуклеотидних неве- ликих ділянок (див. вище).

Подібну рекомбінантну ДНК, яка несе неспоріднені гени із двох різних видів організмів, називають химерною ДНК або хи- мерною плазмідою.

Рис. 86. Схема досліду з генетичної інженерії (за С.Г.Інче-Вечтомовим, 1983):

1– плазміда, оброблена рестриктазою; 2 – фрагменти ДНК, оброблені тією ж рестриктазою; 3 – химерна плазміда; 4 – трансформована бактерія; 5 – трансформовані дочірні клітини

420