n1

До групи нестероїдних анаболіків належать попередники нукле- отидів: оротат калію, рибоксин, деякі похідні піримідинових основ (метилурацил, пентоксил та ін.).

391

Оротат калію – калієва сіль оротової кислоти, яка є провідною сполукою в біосинтезі нуклеотидів, що містять піримідинові основи. Рибоксин (інозин), або гіпоксантин-рибозид є нуклеозидом похідно- го пурину – гіпоксантину. Є дані про здатність препарату підвищува- ти активність ферментів циклу Кребса, стимулювати синтез нуклео- тидів. Ряд препаратів аналогів урацилу (метилурацил, пентоксил та ін.) виявляють анаболічну і антикатаболічну активність. Вони при- скорюють загоєння ран, стимулюють клітинні й гуморальні фактори захисту і т. ін. Механізм їх анаболічної дії пов'язаний головним чи- ном із тим, що вони або найближчі продукти їх обміну є індукторами біосинтезу білка.

Регуляція біосинтезу білків

Питання про регуляцію біосинтезу білків належить до центра- льних проблем біологічної науки. Життєдіяльність живих організмів забезпечується наявністю тонкої, гнучкої, узгоджено діючої системи регуляції.

Уся різноманітність фізіологічних проявів організму пов'язана з функціональними особливостями білків. Тому клітина має у своєму розпорядженні певні біохімічні механізми, які регулюють їхній біосин- тез. Оптимальне співвідношення між кількістю та якістю певних білків відіграє важливу роль у забезпеченні рядужиттєво важливих процесів як для одноклітинних, так і для багатоклітинних організмів. При зміні умов існування припиняється синтез одних і починається синтез інших білків. Стимуляція біосинтезу білків, яка супроводжується збільшенням їх кількості, має назву індукції, а гальмування синтезу білків– репресії. Можливо, у клітинах є речовини, які сигналізують про стан метаболізму в клітині або в організмі. Такими речовинами в прокаріотів можуть бу- ти поживні речовини, які надходять у клітину, метаболіти й деякі внут- рішньоклітинні регулятори (типу циклічних нуклеотидів). У багатоклі- тинних організмів, особливо складноорганізованих, крім автономних внутрішньоклітинних регуляторів, значне місце займають позаклітинні регулятори синтезу білків (наприклад, гормони). Вони підкоряють дія- льність генетичного апарату біосинтезу білків конкретної клітини, тка- нини або органу потребамцілого організму.

392

Багато закономірностей живих організмів розкриваються під час вивчення механізмів регуляції біосинтезу білків. Наприклад, мік- роорганізми дуже швидко пристосовуються до зміни умов існування. У вищих організмів є сувора координація послідовностей процесів росту, диференціації клітин та розвитку. Пристосованість, мінли- вість, спадковість, пухлинна трансформація та багато інших біологі- чних явищ можуть бути пояснені тільки з точки зору регуляції біоси- нтезу білків.

Клітини живих організмів здатні синтезувати величезну кількість різноманітних білків, проте вони ніколи не синтезуються всі, тобто в організмах іде вибірковий синтез білків у відповідності з функціями, які вони повинні виконувати. Наприклад, у кишкової палички вміст одних білків не перевищує 10 молекул на клітину, а вміст інших досягає 50000. Соматичні клітини (а це всі клітини організму, крім статевих) багато- клітинного організму мають однакову генетичну інформацію. Так, майже у всіх клітинах ссавців присутні набори основних білків- ферментів, необхідних для реалізації головних шляхів метаболізму. Проте клітини різних типів, наприклад клітини мозку, печінки, м'язів, підшлункової залози і т.ін., містять властиві тільки їм білкові структури й виконують тільки їм притаманні біологічні функції. Наприклад, клі- тини скелетнихм'язів містять величезну кількість скорочувальних білків (міозин, актин), тоді як у печінці їх дуже мало. Клітини мозку мають набір ферментів, необхідних для синтезу різних медіаторів нервових імпульсів, у той час як клітини печінки їх взагалі не містять. Разом із тим, у печінці ссавців є всі ферменти, необхідні для синтезу сечовини, тоді як в інших тканинах їх немає. Для клітин еритроцитів характерний високий вміст гемоглобіну, клітини підшлункової залози виробляють багато ферментних білків та білок-гормон інсулін. Це пов'язано з тим, що більша частина генетичної інформації, локалізованої в ДНК, забло- кована (зарепресована), тобто не реалізується в процесах біосинтезу бі- лка. Таким чином, із покоління в покоління передається не тільки гене- тична інформація, але й система її регуляції. Усе це свідчить про те, що в живих організмах існують механізми регуляції швидкості білкового синтезу. Вони функціонують під впливом внутрішніх і зовнішніх факто- рів на кожній зі стадій складного процесу біосинтезу білка, починаючи від ДНК до утворення поліпептиду. На схемі вказано основні процеси, від швидкості яких залежить концентрація білка в живій клітині: 1 – транскрипція, 2 – дозрівання і транспорт мРНК із ядра в цитоплаз- му (для еукаріотів), 3 – трансляція, 4 – час існування (життя) мРНК та її розпаду, 5 – протеолізбілка.

393

Розрізняють білки конститутивні та індуцибельні. Консти- тутивні білки, і в тому числі конститутивні ферменти, – це білки, які синтезуються клітиною в сталих кількостях зі сталою швидкіс- тю незалежно від наявності інших субстратів. Рівень конститути- вного синтезу залежить від швидкості синтезу мРНК, швидкості прикріплення до неї рибосом, зчитування матриці й терміну жит- тя мРНК. Транскриптон, який відповідає за синтез конститутив- ного білка, не містить активно діючого оператора (див. нижче). До них належать і ферменти, які беруть участь у головних шляхах катаболізму, наприклад у гліколізі.

Білки, швидкість синтезу яких різко змінюється в залежності від різних умов, одержали назву адаптивних або індуцибельних. Кількість молекул індуцибельних білків варіюється в значних ме- жах. Звичайно, індуцибельний фермент міститься в бактеріальній клітині лише в мізерних кількостях. Якщо ж у середовищі з'явить- ся значна кількість його субстрату, наприклад, при його додаванні в поживне середовище, особливо якщо цей субстрат являє собою єдине джерело енергії й вуглецю для клітин, то концентрація та- кого ферменту може швидко зрости в тисячу й більше разів. Опи- сано велику кількість випадків ферментативної індукції в мікро- організмів. Так, наприклад, кисень індукує утворення цитохромів у дріжджів. Явища індукції дозволяють зрозуміти причину стійко- сті деяких штамів мікроорганізмів до пеніциліну. Пеніцилін інду- кує появу ферменту пеніцилінази в деяких бактерій, який і руйнує антибіотик. Речовини, які здатні індукувати синтез ферменту або групи ферментів, отримали назву індукторів. Індукторами мо- жуть бути й сторонні організмові лікарські засоби (ксенобіотики). Після прийому, накопичуючись, вони індукують синтез ферментів, які каталізують їх метаболізм, внаслідок чого лікарський препа- рат може метаболізуватися й виводитися з організму. Як синте- тичні, так і природні препарати знешкоджуються аналогічними ферментними реакціями.

Іншим важливим типом зміни концентрації ферментів у бакте- ріальній клітині, протилежним за своїм проявом індукції, є репресія ферментів, тобто припинення їх синтезу в присутності кінцевих про- дуктів реакцій, які каталізуються цими ферментами. Так, бактерії типу кишкової палички можуть прекрасно рости на поживному сере- довищі, яке має за джерело азоту сірчанокислий амоній, а за джерело вуглецю – глюкозу. Із цих речовин вони синтезують усі необхідні для їх росту амінокислоти (20), пуринові й піримідинові основи, цукри, ліпіди, тобто вмикають дуже складні метаболічні шляхи синтезу. Але якщо в поживне середовище внести готову амінокислоту, на- приклад триптофан, то її синтез зупиняється – спостерігається реп- ресія цілої низки ферментів, які каталізують процеси біосинтезу да- ної амінокислоти. Індукція й репресія є принципом відображення клітинної економії.

394

Процеси регуляції біосинтезу білків дуже складні, й донині ще повністю не з’ясовані, особливо у вищих організмів (еукаріотів). Проте на сьогодні зібрано значну інформацію про регуляцію синтезу білка в прокаріотів.

Регуляція біосинтезу білків у прокаріотів

Вперше схема регуляції біосинтезу білків у прокаріотів була запропонована французькими вченими Ф.Жакоб і Ж.Моно в 1961 р. Її було розроблено на прикладі лактозного оперону кишкової палички (lac-оперону). На даний час повністю відома первинна структура лактозного оперону – число і порядок чергування нук- леотидів у кожній функціональній ділянці, здійснено його синтез, доведено принцип роботи. Кишкова паличка як джерело енергії та вуглецю за відсутністю глюкози в середовищі може використо- вувати дисахарид лактозу. Якщо вирощувати бактерії кишкової палички E.coli в середовищі, де відсутня лактоза (β-галактозид), то її клітини містять усього лише від однієї до десяти молекул ферменту галактозидази (лактази). При добавленні в поживне се- редовище лактози, кількість ферменту збільшується за кілька хви- лин у сотні й тисячі разів, тобто під впливом субстрату (індукто- ра) стимулюється поява великої кількості ферменту лактази, який гідролітично розщеплює лактозу на D-глюкозу й D-галактозу. Згі- дно з концепцєію Ф.Жакоба і Ж.Моно в lac-опероні розрізняють неоднорідні за функцією гени (рис. 81).

1. Структурні гени (СГ) несуть інформацію про структуру трьох ферментів: β-галактозидази (а), яка гідролізує лактозу до глюкози й галактози; β-галактозидпермеази (б), яка забезпечує транспорт лак- този через мембрану до клітини; β-галактозидацетилази (в), функ- ція якої невідома. При переміщенні ферменту РНК-полімерази по ДНК, СГ зазнають процесу транскрипції, утворюється поліцистрон- на мРНК, яка, потрапляючи до рибосом, починає синтез трьох вище- зазначених ферментів (рис. 81, б ).

2.Ген-оператор (ГО) розташовується між геном-промотором (ГП) та СГ. Це пусковий механізм, який залежно від умов запускає або гальмує процес транскрипції, а отже – й утворення мРНК. Якщо ГО вільний, тобто не зв'язаний з білком-репресором (див. нижче), то СГ транскрибується (рис. 81, б). Якщо ж він зв'язаний із білком- репресором, транскрипція СГ припиняється (рис. 81, а).

3.Ген-промотор (ГП) складається із двох частин. Одна з них служить місцем прикріплення РНК-полімерази. Друга частина ГП служить місцем фіксації комплексу, який утворюється приєднан- ням цАМФ (див. нижче) до спеціального білка, який позначається або БАК (білок-активатор катаболітного гена), або САР (ката-

болітний ген-активуючий білок). Це є обов’язковою умовою утворення відкритого комплексу РНК-полімерази із промотором і початком її роботи. Утворення комплексу БАК-цАМФ визначаєть- ся концентрацією цАМФ, яка, у свою чергу, залежить від наявнос-

395

ті глюкози. За відсутності останньої вміст цАМФ у клітині значно підвищується, що сприяє утворенню комплексу. Комплекс, зв’язуючись із промотором, змінює просторову структуру даної ділянки ДНК таким чином, що стає можливим приєднання до нього РНК-полімерази. Це збільшує швидкість транскрипції опе- рону (рис. 81, б). У присутності глюкози вміст цАМФ зменшуєть- ся, комплекс БАК-цАМФ не утворюється й РНК-полімераза не може з'єднатися з промотором; тому транскрипція lac-генів не відбувається. Отже, у клітині є ще один, додатковий БАК-цАМФ регулятор, який діє як позитивний регулятор, оскільки його при- сутність є необхідною для початку роботи гена.

Рис. 81. Регуляція синтезу білка (за Жакоб і Моно). Пояснення в тексті

Циклічний аденозинмонофосфат (цАМФ) є універсальним вну- трішньоклітинним регулятором, утворюється з АТФ у присутності ферменту аденілатциклази:

396

Вміст самого цАМФ також регулюється станом активності фе- рментів аденілатциклази і фосфодиестерази, руйнуючої цАМФ (див. Гормони).

4. Ген-регулятор (ГР) забезпечує синтез особливого білка- репресора. Свою назву він одержав завдяки тому, що його дія на ген-оператор гальмує (репресує) функціонування останнього, у ре- зультаті чого зупиняється транскрипція. Білок-репресор за відсут- ності індуктора дуже споріднений із геном-оператором і може лег- ко приєднуватися до нього. З іншого боку, білок-репресор здатний до специфічної взаємодії з певними низькомолекулярними речови- нами (індукторами), зокрема для lac-оперона – із лактозою. За від- сутності лактози оператор блокується за рахунок приєднання до нього білка-репресора, тобто процес транскрипції не відбувається. Білок-репресор знаходиться у зв'язаному стані з оператором до то- го часу, поки не з'явиться лактоза, і він вступить у взаємодію з нею. Лактоза, зв’язуючись з білком-репресором, змінює його конформа- цію, у результаті чого він втрачає здатність приєднуватися до опе- ратора. Оператор вивільняється й починається транскрипція й син- тез ферментів катаболізму лактози (рис. 81). Таким чином, за учас- тю білка-репресора, який утворюється початково в активній, тобто здатній до зв'язування з оператором формі, й індуктора, який пере- водить білок-репресор у неактивну форму, відбувається регуляція синтезу індуцибельних ферментів. Обов'язковою умовою цього ме- ханізму регуляції є нестабільність мРНК, тобто після вичерпування всієї лактози в середовищі, мРНК повинна бути зруйнована, щоб зупинити біосинтез непотрібних уже ферментів метаболізму лак- този. Це відбувається внаслідок гідролізу мРНК під впливом фер- ментів рибонуклеаз (див. вище схему). мРНК у бактерій синтезу- ється швидко, і час її напівжиття вимірюється хвилинами. У бага-

397

токлітинних організмів мРНК може існувати протягом годин, днів, є також мРНК і з більшим терміном існування.

Як уже було сказано, окрім індукції генів у клітинах відбувається їх репресія. Дія цих оперонів також контролюється за допомогою бі- лків-репресорів, але на відміну від індукції, вони синтезуються поча- тково в неактивній формі. І тільки приєднання до них накопиченого продукту ферментативної реакції – корепресора переводить їх в активну форму, що супроводжується зв'язуванням їх з оператором і припиненням синтезу білка.

Як приклад регуляції шляхом репресії синтезу білків-ферментів можна взяти гістидиновий оперон бактерій. Цей оперон містить 10 структурних цистронів, які кодують 10 ферментів, необхідних для синтезу гістидину. Ферменти утворюються тільки в тому випадку, коли в середовищі немає гістидину і клітини вимушені самі синтезу- вати його з інших речовин. Додавання в середовище гістидину при- пиняє синтез ферментів (рис. 82).

Незважаючи на протилежний результат індукції й репресії син- тезу білків, їх молекулярні механізми дуже схожі.

Рис. 82. Репресія кінцевим продуктом гістидинового оперону

398

У більшості вивчених випадків індуцибельними є оперони, від- повідальні за синтез ферментів, які каталізують катаболічні реакції (розпад амінокислот, дисахаридів, зброджування цукрів та ін.). Інду- кторами таких оперонів, які переводять активний репресор у неак- тивну форму, є субстрати цих катаболічних ферментів. Найчастіше репресовані оперони – це системи синтезу анаболічних ферментів, які каталізують реакції синтезу амінокислот, азотистих основ і т.ін. Корепресором, який активує білок-репресор, можуть виступати про- дукти, що синтезуються ферментами даного оперону. Якщо ген- регулятор розташовується спереду групи оперонів, які кодують фер- менти, відповідальні за різні проміжні реакції синтезу однієї й тієї ж сполуки, то він контролює роботу всіх оперонів за участю єдиного репресора.

Наведені вище механізми регуляції швидкості білкового синтезу на рівні транскрипції не вичерпують усі відомі на сьогодні дані в цій галузі досліджень. Існують механізми регуляції біосинтезу білка й на рівні трансляції. Регуляторну роль тут виконують головним чином тРНК. Активація, пригнічення синтезу тРНК, порушення їхньої стру- ктури є факторами регуляції біосинтезу білка на цьому рівні.

Найважливішим досягненням у галузі регуляції біосинтезу білка стало виділення білка-репресора й вивчення його хімічної будови. В останні роки виділено ряд репресорів: репресори синтезу аргініну, триптофану, lac-оперону та ін. Репресор lac-оперону кишкової палич- ки являє собою термолабільний білок з молекулярною масою 150000, який складається з чотирьох субодиниць.

Функціонування lac-оперону з кишкової палички було відтворено in vitro: при введенні у структуру lac-оперону РНК-полімерази, індук- тора (лактози), попередників синтезу РНК та інших факторів відбу- вався процес біосинтезу мРНК.

Концепція Жакоба і Моно щодо механізму проявлення активно- сті генів стала логічним розвитком численних досліджень, здійсне- них генетиками й біохіміками в минулі десятиріччя.

Регуляція біосинтезу білків в еукаріотів

Механізм регуляції біосинтезу білків в еукаріотів вивчено наба- гато менше, ніж у прокаріотів. В останні роки завдяки дослідженням в галузі генної інженерії було досягнуто значного прогресу в розу- мінні експресії еукаріотичних генів.

Вважають, що основні принципи регуляції в них аналогічні про- каріотам, але в цілому цей процес є складнішим і відбувається інак- ше. У еукаріотів існує ряд точок прикладання регуляторних впливів, які абсолютно відсутні в прокаріотів. Для еукаріотів не характерна пряма субстратна регуляція, розповсюджена в прокаріотів. В еукарі- отів не знайдено регуляторних білків типу білків-репресорів бакте- рій, які поєднують у собі функції розпізнавача хімічних сигналів ме- таболізму (специфічно зв'язують свої метаболіти) і регулятора транскрипції оперонів. У ссавців і вищих рослин хроматин, організо- ваний у хромосоми, побудований значно складніше, ніж у бактерій.

399

Генетичний матеріал знаходиться в ядрі, яке оточується ядерною мембраною. Тому процеси транскрипції (ядро) і трансляції (цито- плазма) розділені, оскільки рибосоми знаходяться в основному в ци- топлазмі. Експресія генів в еукаріотів складається з набагато більшої кількості етапів, ніж у прокаріотів, особливо це стосується процесин- гу пре-мРНК. Складнішим є й зворотний зв'язок – вплив метаболітів та інших хімічних регуляторів цитоплазми на активність генів (що легко здійснюється в бактерій). Відмінність у регуляції зумовлена також міжклітинними взаємодіями, диференціацією клітин. На від- міну від прокаріотів, оперони еукаріотів, як правило, моноцистронні, з дуже великими регуляторними зонами. Це пов'язано з їхньою зда- тністю сприймати велику кількість різних факторів, які змінюють транскрипційну активність. В еукаріотів структурні гени, що відпові- дають за різні ланки того чи іншого ланцюга біохімічних реакцій, як правило, розкидані по геному, а не зосереджені в одному опероні, що часто спостерігається в прокаріотів. У ядрах диференційованих клі- тин більшість генів знаходиться в репресованому стані: водночас в середньому зчитуються тільки біля 10% генів.

Усі структурні гени еукаріотів умовно розподіляють на три ти- пи: а) гени, які функціонують в усіх клітинах організму (наприклад, гени, які відповідають за синтез ферментів енергетичного обміну); б) гени, які функціонують тільки в тканинах одного типу (зокрема, синтез міозину в м'язовій тканині); в) гени, необхідні для виконання клітинами специфічних функцій (наприклад, синтезбілкакришталика).

Було показано, що на експресію еукаріотичних генів впливає ам- пліфікація й перебудова генів. Відомо, що у формуванні хроматину беруть участь ДНК, білки та невелика кількість РНК. ДНК асоцію- ється з гістонами й негістоновими білками. Встановлено, що гістони й негістонові білки (НГБ) виконують важливу роль у проявленні ак- тивності генома. Так, у дослідах на тваринах було показано, що при видаленні гістонів шляхом розщеплення трипсином, активується си- нтез РНК і білків. При добавленні гістонів ці процеси пригнічували- ся. У прокаріотів гістони відсутні. Гістони містять велику кількість залишків диаміномонокарбонових кислот (аргініну, лізину) і мають позитивний заряд. Тому вони легко зв'язуються з негативно заря- дженими залишками фосфорної кислоти полінуклеотидних ланцюгів ДНК і блокують процес РНК-полімеразної реакції. Гістони найбіль- ше, у порівнянні з іншими білками, зазнають модифікації. Вони мо- жуть фосфорилюватися за рахунок АТФ у присутності ферменту протеїнкінази, а також ацетилюватися і метилюватися, що призво- дить до послаблення або нейтралізації позитивного заряду. Внаслі- док цього гістони змінюють рівень укладки ДНК і, таким чином, ре- гулюють її матричну активність, тобто втрачають свою гальмівну здатність, тому що ослабляється зв'язок між ДНК і гістонами.

Невелика різноманітність і гетерогенність гістонових білків (усього 5 різних фракцій, хоча модифікація і збільшує їх кількість) не дає змоги цілком пояснити регуляцію функціональної активності ДНК. У зв'язку з цим велика увага приділяється НГБ, до складу яких

400