n1

входить більше кислих білків, що містять залишки моноамінодикар- бонових кислот. Негістонові білки відрізняються великою різнома- нітністю. Відомо близько 500–600 фракцій, тому вважається, що вони виконують роль специфічних регуляторів транскрипції. Вони несуть негативний заряд, проте можуть бути також зв'язаними безпосеред- ньо з ДНК, причому не взагалі з будь-якими її ділянками, а специфі- чно, полегшуючи транскрипцію в місці зв'язування з ДНК. Вони, як і гістони, можуть у складі хроматину оборотно модифікуватися завдя- ки реакціям фосфорилювання, метилювання, ацетилювання, АДФ- рибозилювання та ін., при цьому змінюється міцність зв'язку з ДНК та кількість місць ініціації транскрипції. Однак ще недостатньо ви- вчено молекулярний механізм включення транскрипції негістонови- ми білками. Можливо, набуваючи великого негативного заряду, во- ни або утворюють комплекс із позитивно зарядженими гістонами, відтісняючи їх у певній ділянці від ДНК, або дестабілізують молеку- лу ДНК, взаємодіючи безпосередньо з нею. Цим полегшуються про- цеси транскрипції. На рис. 83 представлено приблизну схему регуля- ції транскрипції білками хроматину.

Третій тип регуляторів транскрипції – це молекули, так званої векторної РНК, яка знаходиться в ядрі, не залишаючи його, у ком- плексі з білком у вигляді рибонуклеопротеїну (РНП), який може ви- бірково вмикати гени шляхом комплементарної взаємодії з акцеп- торними ділянками транскриптонів.

Рис. 83. Гістони перешкоджають транскрипції ділянок ДНК, із якими вони зв'язані. Гальмування припиняється фосфорилюванням гісто-

нів за рахунок АТФ у присутності протеїнкінази (1). Наявність негістонових білків також перешкоджає цьому гальмуванню (2). І в першому, і в другому випадках утворюється мРНК

Гістони, негістонові білки й векторна РНК нерівномірно розпо- ділені уздовж полінуклеотидних ланцюгів ДНК хроматину. Окремі ділянки залишаються вільними. Усе це обумовлює різний ступінь розрепресованості окремих ділянок ДНК. Стан ДНК у прокаріотів відрізняється в порівнянні з еукаріотичною клітиною. У бактеріаль- ній клітині ДНК знаходиться у відносно вільній формі.

В еукаріотичних організмів широко розповсюджена регуляція активності генів особливими сигнальними речовинами, які вироб- ляються іншими клітинами. Прикладами таких сигнальних сполук

401

можуть бути гормони, які діють на клітини-мішені (див. Гормони), нейромедіатори, біогенні аміни. Наприклад, індукторами можуть бути деякі стероїдні гормони, тироксин, які легко проходять клітин- ну мембрану, утворюють у цитоплазмі клітини комплекси зі специ- фічними білками-рецепторами, змінюючи їх конформацію. В акти- вованій формі гормон-рецепторний комплекс проникає в ядро, де, зв’язуючись із регуляторними білками хроматину (гістони, НГБ) або з ДНК, сприяють їх модифікації завдяки або прямому зв'язуванню з ними, або активації ферментів, які здійснюють фосфорилювання, ацетилювання, метилювання, регулюючи при цьому транскрипцію «своїх» генів і синтез специфічних білків. Будь-який із цих механізмів полегшує зв'язування РНК-полімерази із промотором і забезпечує утворення пре-мРНК, а потім – і білка.

Багато гормонів (адреналін, глюкагон та ін.) сполучаються з ре- цепторами мембран клітин і впливають на синтез білка через систему цАМФ-протеїнкінази, а отже, на процес фосфорилювання різних біл- ків, у тому числі й хроматинових. Фосфорилювання білків хроматину впливає на експресію генів, контролюючи тим самим швидкість син- тезу ферментів та інших білків. Після припинення дії індуктора відбу- вається відщеплення модифікуючих груп від гістонів і вони, знову сполучаючись з ДНК, припиняють транскрипцію. НГБ зазнають таких же змін. В еукаріотів, на відміну від прокаріотів, блокада транскрипції не означає ще припинення біосинтезу білка, оскільки мРНК, які утво- рюються, стабільніші й довше існують, що дає можливість використо- вувати їх як матрицю для синтезу білка на рибосомах і після того, як утворення нових мРНК при транскрипції вже заблоковано.

Регуляція на рівні трансляції можлива завдяки дії регуляторів на різні білкові фактори, які контролюють у рибосомах різні етапи трансляції, і на різні функціональні ділянки рибосом.

Таким чином, шляхи регуляції біосинтезу білка в еукаріотів чис- ленні і взаємопов’язані. Але конкретні молекулярні механізми цієї регуляції ще вивчаються.

Мутації. Молекулярна патологія

Молекулярні механізми генетичної мінливості

Процес поділу клітин надзвичайно точний і призводить до появи величезної кількості клітин з однаковим набором хромосом. Проте хромосоми – це не інертні, стабільні структури, які незрушно зберіга- ють генетичну інформацію в початковому вигляді. Вони постійно за- знають різного роду змін. Окремі перебудови в хромосомах відбува- ються в процесі нормальної життєдіяльності організму (переміщення окремих генів або їх груп у межах як однієї й тієї ж хромосоми, так і між різними хромосомами – транспозиція; генетична рекомбінація під час злиття статевих клітин; упровадження вірусів у геном організ- му, трансформація і кон'югація бактерій та ін.).

Гени несуть інформацію, котра визначає характер взаємодії клі- тини із зовнішнім та внутрішнім середовищем організму. Вони від-

402

різняються високою стійкістю і здатні залишатися незмінними про- тягом багатьох поколінь. Проте, незважаючи на стійкість, гени зда- тні змінюватися (мутувати) під впливом радіації, хімічних і біологіч- них факторів. Такі змінені гени називають мутантними. Вони несуть перекручену інформацію. Деякі зміни в ДНК носять випадковий, спонтанний характер і легко зазнають виправлення, оскільки орга- нізм має могутні системи репарації (відновлення) структури ДНК. Генетична інформація в ДНК записана в обох ланцюгах подвійної спіралі і, завдяки їх комплементарності, інформацію, втрачену в од- ному з ланцюгів, можна відновити за допомогою іншого ланцюга. Наприклад, у ході реплікації в ДНК можуть виникнути одноланцю- гові розриви. Ці розриви відновлюються завдяки ДНК-полімеразі I і ДНК-лігазі. Таким же чином може бути замінений помилково вбу- дований нуклеотид завдяки коригуючій здатності ферментів.

Дія різноманітних факторів зовнішнього і внутрішнього середо- вища призводить до змін в ДНК. Якщо клітина не виправляє зміни, які виникають, це призводить до появи успадкованої зміни – мутації. Мутації – це зміни в нуклеотидній послідовності гена. Фактори, що призводять до мутацій, отримали назву мутагенів. Мутації бувають хромосомні, що охоплюють хромосому або більшу її частину і точко- ві, або генні. До мутацій призводять різноманітні впливи: зміна ге- нетичного матеріалу внаслідок дії хімічних агентів; включення ана- логів азотистих основ, які спричиняють помилки при реплікації ДНК, наприклад, включення 5-бромурацилу замість тиміну; дода- вання деяких хімічних сполук, які самі не включаються в ДНК, але викликають аномалії під час її реплікації, наприклад, похідні акриди- ну, хіноліну; дія іонізуючого випромінювання (ультрафіолетового, рентгенівського, радіоактивного, космічного). Ультрафіолетове (УФ) випромінювання, яке складає значну частину сонячного спект- ра, може викликати хімічні зміни в ДНК клітин шкірного покриву.

У результаті поглинання УФ-проміння пуринові й піримідинові основи переходять у збуджений стан, за якого можливі ковалентні зміни, наприклад, утворення димерів тимідилової кислоти між дво- ма сусідніми тимінами з утворенням між ними циклобутанового кі- льця. Димери можуть виявитися нездоланною перешкодою для ДНК-полімерази при реплікації тієї частини полінуклеотидного лан- цюга, який знаходиться за димером.

Димер тимідилових кислот, де R – залишок дезоксирибозофосфату

403

Іонізуюче випромінювання може «вибити» один або декілька електронів з біомолекул, що призводить до утворення вільних ради- калів, нестабільних іонів, перекисних сполук, які викликають у ДНК аномальні хімічні зміни азотистих основ і розрив нуклеотидних лан- цюгів. Цим пояснюється летальна дія іонізуючої радіації. На щастя, більша частина цих пошкоджень швидко виправляється клітинами за допомогою ферментативних механізмів.

Численні пошкодження виникають за дії різних хімічних сполук, які призводять до дезамінування основ, відщеплення їх і утворення кова- лентних зв'язків між ланцюгами ДНК. Частіше при цьому відбувається гідролітичне відщеплення пуринових основ. У результаті депуринізації ДНК диплоїдних клітин людина за добу може втрачати біля 5 104 нук- леотидів. Менш характерним є процес депіримідинізації. У клітині іс- нують системи репарації (ДНК-ферментативні механізми), які виявля- ють і виправляють пошкодження. Якщо узагальнити, репарація відбу- вається таким чином. Наприклад, якщо пошкоджено азотисті основи, то вони виявляються і видаляються ДНК-глікозидазами, які гідроліти- чно розщеплюють зв'язок між пошкодженою основою й дезоксирибоз- ним залишком. У результаті цього на молекулі ДНК утворюється пен- тозофосфатний ланцюг без азотистих основ. Специфічні ендонуклеази впізнають такі ділянки і видаляють деяку кількість нуклеотидних зали- шків по обидві сторони від місця розриву, а потім ДНК-полімераза I добудовуєпошкодженийнуклеотидний ланцюг. Відомо декілька систем репарації, які видаляють пошкодження різного типу.

Генні мутації. Це успадковані зміни первинної структури ДНК, які призводять або до припинення синтезу білка, котрий кодується пошкодженим геном, або до синтезу зміненого, дефектного білка. Мутації в регуляторних ділянках оперону призводять до порушення регуляції або припинення біосинтезу білка. Механізми мутагенезу складні й недостатньо вивчені.

На молекулярному рівні розрізняють декілька типів точкових (генних) мутацій.

Заміна однієї основи на іншу (АТЦ → АТТ). У цьому випадку змі- нюється кодуюче значення одного із триплетів ДНК і кодонів мРНК, внаслідок чого у відповідному білку одна амінокислота замінюється на іншу. Дія деяких мутагенів ґрунтується на хімічних модифікаціях основ ДНК. Так, за дії азотистої кислоти (попередниками її є нітрити, нітрати, нітрозоаміни) цитозин, зазнаючи окислювального дезамінування, пе- ретворюється на урацил, який поводить себе при кодуванні як тимін. Внаслідок цього змінюється комплементарна взаємодія: якщо вихідний цитозин є комплементарним гуаніну, то утворений урацил– аденіну, тобто змінюється зміст кодонів, що призводить до синтезу зміненого білка. Аденін може перетворитися на 6-гідроксипурин (гіпоксантин), який відповідає вже не тиміну, а цитозину. Джерелами нітратів є голо- вним чином мінеральні добрива. Нітрати в процесі бактеріального від- новлення перетворюються на нітрити, які в результаті реакції з вто- ринними амінами перетворюються на нітрозоаміни. Іншими джерела-

404

ми азотовмісних сполук, які викликають дезамінування, можуть бути побутові й каналізаційні стічні води, відходи промислових виробництв, розпад органічнихзалишків іт. ін.

Гідроксиламін (H2NOH) – високоспецифічний мутаген. Він реа- гує майже виключно з цитозином, і дає похідні, які спарюються з аденіном, а не з гуаніном:

Якщо в результаті заміни з кодонів утворюється один із термі- нуючих триплетів (УГА, УАГ, УАА), то синтез поліпептидного лан- цюга обривається, і утворюється незавершений поліпептидний лан- цюг білка.

Інверсія – зміна місць двох сусідніх нуклеотидів, наприклад АТЦ → АЦТ, як і заміщення, призводить до зміни значення кодонів і до заміни амінокислоти або до обриву синтезу поліпептиду, якщо це переміщення спричинить появу термінуючих триплетів.

Делеція – випадання (втрата) частини генетичного матеріалу, яке може обмежуватися одним і більше нуклеотидом ДНК (АЦТ→ АЦ_). За підвищеної температури, зміни рН, за дії алкілую- чих речовин можуть утворюватися похідні азотистих основ, нездатні до комплементарного спарювання, що призводить до випадання ос- нов у кодонах, наприклад:

405

Утворений 6-метоксигуанін втрачає здатність комплементарно взаємодіяти з цитозином. Пропуск основи спричиняє зсунення рамки зчитування, а отже, порушення структури поліпептиду, що кодується:

Алкілуючі агенти – це широкий клас органічних сполук, які хара- ктеризуються виключною реакційною активністю. Вони є джерела- ми введення в молекулу ДНК метилових, етилових, пропілових та інших радикалів.

Делеція може захопити частину цистрону або навіть декілька цистронів. При цьому синтез одного або декількох білків буде немо- жливим. Якщо делеція відбувається в зоні гена-регулятора, синтез відповідного білка стає нерегульованим.

Вставка зайвого нуклеотиду всередині полінуклеотидного лан- цюга ДНК, як і делеція, призводить до зсунення рамки зчитування всього ланцюга нуклеотидів (АТЦ → АТТЦ). Внаслідок зміни нук- леотидної послідовності гена змінюється й послідовність нуклеоти- дів мРНК, яка із нього зчитується. Оскільки остання не має знаків пунктуації, то синтезується зовсім інший білок.

Проте, якщо делеція або вставка охоплює не одну або дві основи кодону, а три поряд розташовані нуклеотиди, то порядок чергування наступних за ними кодонів зберігається; далі за зміненою ділянкою білок зберігає нормальну структуру.

Мутації зі зрушенням рамки (делеція, вставка) можуть індукува- тися деякими великими плоскими ароматичними молекулами, поді- бними до звичайних основ або пар основ ДНК. Такі молекули здатні інтеркалювати (тобто вбудовуватися) між азотистими основами, внаслідок чого в ДНК з'являються додаткові основи. Наприклад, по- хідні акридину (акридинові барвники) можуть вбудовуватись між су- сідніми парами основ ДНК, потіснюючи їх. При реплікації ДНК у но- вий ланцюг навпроти акридину включається додаткова основа:

Наслідки мутацій стосовно структури та функції білків. Мутації

можуть бути нейтральними, мовчазними, корисними та шкідливими (патологічними).

406

Мовчазна мутація – коли заміна однієї основи в триплеті не змі- нює його змісту. Частіше це стосується третього нуклеотиду трипле- ту. Наприклад, амінокислота аланін має 4 кодони (ГЦА, ГЦГ, ГЦУ, ГЦЦ); вони розрізняються тільки останньою основою, тому до мРНК усе одно буде приєднуватися своїм антикодоном тРНК, спо- лучена з аланіном.

Нейтральна мутація – коли одна амінокислота замінюється на іншу, подібну за властивостями і розміром, за зарядом, за гідрофоб- ністю (еквівалентна заміна). Наприклад, замість лейцину маємо ізо- лейцин і навпаки. Утворюється трохи змінений білок, але його біо- логічні властивості при цьому істотно не змінюються – обидва за- лишки амінокислот гідрофобні.

Корисна мутація. Якщо в результаті мутації якості білка зміню- ються таким чином, що організм одержує переваги для виживання,

то ця мутація вважається біологічно корисною.

Патологічна мутація. До них належать мутації, внаслідок яких змінюється амінокислотний склад в дуже важливих ділянках, напри- клад в активному центрі ферменту, рецептора, у стратегічно важли- вих фрагментах третинної структури протомеру чи в четвертинній структурі білка і т.ін. Наприклад, в активному центрі ацетилхолінес- терази є чотири залишки амінокислот: серину, гістидину, тирозину і глутамінової кислоти. Якщо в результаті мутації серин замінити на фенілаланін, то такий фермент не зможе здійснити розщеплення ацетилхоліну:

Питання про мутагенні ефекти лікарських засобів має важливе значення для людини. Перевірка на мутагенність лікарських речовин стала підставою для заборони деяких із них і обмеження застосуван- ня інших. Дослідження мутагенності, тератогенності (вплив на роз- виток ембріона і плоду) і канцерогенності є обов'язковим при доклі- нічному вивченні нових лікарських засобів.

Частота мутацій. Мутації, на відміну від репаруючих ушкоджень

ДНК, є порівняно рідкісними явищами. При реплікації вони склада- ють один помилковий нуклеотид на 109 – 1010 нуклеотидів, при транс- крипції – на 105 – 106 та при трансляції – на 104 нуклеотидів. На сього- дні в людини визначені мутації в 2500 різних генах, багато з них погі- ршують ті чи інші функції або призводять врешті-решт до летального результату. Інші гени людини, що зазнають мутацій, ще не відкриті. Очевидно, кількість виявлених спадкових захворювань людини буде зростати у міру виявлення методів, здатних реєструвати наслідки му- тацій. Спадкові хвороби ставлять перед біохімією і медициною виня- тково важливе завдання щодо їх визначення та лікування.

Антимутагени та радіопротектори. У боротьбі проти впливу му-

тагенів на організм людини великі перспективи відкривають дослі-

407

дження з виявлення антимутагенів, тобто сполук, здатних ослаблю- вати дію чи захищати молекулу ДНК від дії мутагенних факторів. Вперше той факт, що за допомогою деяких речовин можна не тільки посилювати, але і пригнічувати процес мутації, був відкритий на по- чатку 50-х років. Було відзначено, що додавання в середовище для вирощування бактерій деяких пуринових нуклеозидів, що входять до складу ДНК, призводить до зниження кількості спонтанних (природ- них) мутацій на 60–70%. Це явище стали називати антимутагенезом, а самі речовини – антимутагенами. Зараз уже відомо біля 200 при- родних та синтетичних сполук, що здатні знижувати частоту мутацій. Серед них деякі амінокислоти і їх похідні (цистеїн, цистин, гістидин, аргінін, метіонін, цистамін та ін.); вітаміни, провітаміни, вітаміно- подібні речовини (аскорбінова, фолієва та параамінобензойна кис- лоти, ретиналь (похідне вітаміну А), каротин, токофероли, філохі- нон (вітамін К) та ін.); ферменти (пероксидаза, НАДФ-оксидаза, ка- талаза, глутатіонпероксидаза та ін.); комплекси сполук, які входять до складу різних продуктів рослинного та тваринного походження; фармакологічні засоби (сульфаніламіди, препарати фенотиазиново- го типу, гексамідин, інтерферон та ін.); велика група речовин, які ви- являють антиокислювальні властивості (похідні галової кислоти, іо- нол, оксипіридини, дигідропіридини, деякі солі селену та ін.); мікро- і макроелементи (солі кобальту та ін.).

Ці ж речовини застосовуються в радіобіології для захисту біоло- гічних систем від пошкоджень (радіопротектори).

Існують такі основні шляхи дії антимутагенів: нейтралізація му- тагену до його взаємодії з ДНК; запобігання утворенню в процесі метаболічної активації мутагенних сполук із нетоксичних попере- дників; запобігання помилок у процесі реплікації ДНК, активація ре- парації та інших внутрішньоклітинних систем підтримання ціліснос- ті генетичного матеріалу.

Особливу роль відіграватимуть антимутагени, які можна вико- ристовувати як харчові добавки й антимутагенні ліки.

Необхідно продовжувати наукові дослідження зі створення ефе- ктивних антимутагенів і нових механізмів їх впливу на ДНК.

Молекулярна патологія біосинтезу білків

Як відомо, закодована в ДНК генетична інформація перено- ситься на білки, що синтезуються, в тому числі на білки-ферменти, і, таким чином, впливає на обмін речовин, зумовлюючи формування специфічних для організму ферментних систем. Генетично зумовле- ні зміни біосинтезу як ферментних, так і неферментних білків при- зводять до порушення їх структури й до різних відхилень в обміні ре- човин, тобто викликають так звані молекулярні хвороби. У 1959 р. Л.Полінг, В.Інгрем та інші показали, що в дітей, хворих на серпопо- дібно-клітинну анемію, молекула гемоглобіну має аномальну будо- ву. Відмінність була пов'язана із заміною однієї з 3 109 основ, які складають повний геном нормального гемоглобіну людини (НbА). При цьому в шостому триплеті β-глобінового гена ДНК було вияв-

408

лено мутацію, у результаті якої тимін заміщався на аденін. Із зміне- ного кодону зчитується не глутамінова кислота, а валін, що призво- дить до структурних порушень β-субодиниці глобіну і появи серпо- подібно-клітинного гемоглобіну – HbS:

Ця заміна в поліпептидному ланцюзі впливає на фізико-хімічні властивості гемоглобіну. Валін – неполярна незаряджена амінокис- лота, заміщуючи полярну з негативним зарядом глутамінову кисло- ту, надає гемоглобіну позитивнішого заряду і меншої розчинності, тому він утворює кристалоподібні структури, які, випадаючи у ви- гляді осаду, змінюють форму еритроцитів з округлої на серпоподіб- ну. Еритроцити стають ламкими, не здатними виконувати функції із транспорту кисню. Розпад еритроцитів призводить до анемії; капі- ляри, де звичайно оксигемоглобін віддає свій кисень, можуть заку- порюватися зміненими еритроцитами, що призводить до масивного гемолізу й до омертвіння ділянок тканин. Хвороба спадкова, проті- кає гостро й діти часто гинуть у ранньому віці. Серпоподібно- клітинна анемія поширена в країнах Південної Америки, Африки і Південно-Східної Азії.

Це відкриття обумовило виникнення термінів «молекулярна патологія», «молекулярна хвороба». Отже, молекулярні хвороби – це захворювання, основною причиною яких є генетично обумовлене порушення структури білків (протеїнопатії). На сьогодні відомо бли- зько тисячі спадкових молекулярних хвороб з порушенням біосинте- зу білків, особливо білків-ферментів. Протеїнопатії розділяють на дві групи: ферментні (ферментопатії або ензимопатії) і нефермент- ні. Перші пов'язані з дефектами ферментних білків, які призводять до порушень певної ланки метаболізму, а другі – з дефектом нефер- ментних білків: транспортних, рецепторних, імунних і т.ін. Приклади деяких протеїнопатій білкового (амінокислотного) обміну представ- лено в табл. 15. Ензимопатії вуглеводного й ліпідного обмінів наве-

дені у відповідних розділах обміну речовин.

Таким чином, різні форми молекулярної патології в основному пов’язані з «помилками» генетичного апарату при кодуванні струк- тури білків, особливо білків-ферментів. Найважливішим завданням генетичних досліджень є пізнання механізмів цих «помилок» у гене- тичному коді й усунення причин, які їх породжують. Реальний шлях до вирішення цього завдання – боротьба за чистоту навколишнього середовища, особливо захист від дії проникаючої радіації й хімічних мутагенних факторів.

409

Таблиця 15

Приклади молекулярних порушень білкового й амінокислотного обмінів

410