Задание 4.Знакомство с принципами измерения электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток

Сущность метода состоит в том, что на определенном участке полоски ГМК путем длительного выдерживания в изотоническом растворе сахарозы создается высокое сопротивление межклеточного пространства. Электрическая схема волокна, помещенного в раствор сахарозы, представлена на рис. 13.

Для расчетов используется уравнение Кирхгоффа:

Исходя из уравнения Кирхгоффа (1), если слева от сахарозного участка препарат погружен в изотонический раствор KCl, то Еm стремится к нулю:

Следовательно, формула (1) примет вид:

Если Rc достаточно велико, то Еx будет стремиться к Ем. Для выполнения этого условия удельное сопротивление сахарозы должно быть не менее 0. 5·10 ⁶Ом-см.

В настоящей работе используются две сахарозные секции толщиной 2,5 мм из органического стекла и камера Кребса толщиной 0,8 мм, в которую помещается исследуемый участок полоски ГМК.

Для предотвращения смешивания растворов сахарозные секции отделяются от камеры Кребса резиновыми перегородками, диаметр отверстий в которых прожигается несколько меньше толщины исследуемого препарата. В представленной установке применяются сахарозные секции в виде пузырьковых камер. Они представляют собой полусферы, вырезанные в сахарозной секции, которые при помощи воздуховодов соединяются с поршнями и участвуют в регуляции натяжения резиновых прокладок, что позволяет изменять диаметр отверстий и лучшему разграничению перфузионных жидкостей.

Сахарозные секции и камера Кребса делят препарат на четыре участка. Первый находится в изотоническом растворе КСl, второй и четвертый в растворе сахарозы, третий в растворе Кребса. В третий и четвертый участки помещаются раздражающие электроды, соединенные со стимулятором С-1-50. В первый и третий участки помещаются неполяризующиеся электроды с агар-агаровым мостиком. Через сахарозные секции перфузируется изотонический раствор сахарозы, через камеру Кребса физиологический раствор Кребса и тестирующие растворы, приготовленные на его основе.

Рисунок 13. Электрическая схема волокна, помещенного в раствор сахарозы. Rс сопротивление сахарозы, Ri сопротивление цитоплазмы, Cm₁ и Cm₂ емкости, Rм₁ и Rм₂ сопротивления мембранных элементов слева и справа соответственно, Еx электродная разность потенциалов между левой и правой сторонами волокна от сахарозного участка, Ем₁ и Ем₂ мембранный потенциал всех мембранных элементов слева и справа от сахарозного участка соответственно

Сборка установки (рис. 14) должна осуществляться под руководством преподавателя или лаборанта-исследователя.

Рисунок 14. Схема установки двойного сахарозного мостика. 1 первая сахарозная секция; 2 вторая сахарозная секция; 3 камера Кребса; 4 резиновые перегородки; 5 отводящие электроды 6 раздражающие электроды 7 шелковая нить; 8 полоска гладкомышечной ткани; 9 камера с изотоническим KCl

Последовательность действий при выполнении работы.

1) Собрать установку.

2) Приготовить раствор Кребса следующего состава: (мМ): NaCl-120. 4, KCl-5. 9, CaCl₂-2. 8, NaHCO₃-15. 5, NaH₂PO₄-1. 2, MgCl₂-1. 2, глюкоза -11. 5.

3) Довести pH раствора до 7. 3-7. 4.

4) Приготовить раствор сахарозы (332,7 мМ)

5) Приготовить изолированные полоски гладкомышечной ткани диаметром 0,2 мм, длиной 10 – 12 мм. На концах завязываются тонкие шелковые нити для крепления препарата в установке.

6) Установить препарата в установку и перфузировать сахарозой и соответствующими растворами в течение 45 мин. Раствор Кребса подогревается до температуры 37⁰С, скорость перфузии 1 мл/мин.

ЗАДАЧА 1

1) Попеременно включая тумблер радиочастотного выхода электростимулятора в положение «+» и «-», провести раздражение препарата прямоугольными импульсами, начиная с амплитуды 10 мкА, длительностью 3 – 5 с.

2) Зарегистрировать изменение мембранного потенциала в мВ на регистраторе. Зная сопротивление в цепи стимулятора (1 МОм), рассчитать силу тока оп закону Ома.

3) Построить вольт-амперную характеристику гладкомышечной полоски.

ЗАДАЧА 2.

1) Получить предсокращение гладкомышечной полоски при действии деполяризующих (гиперкалиевый раствор) или контрактильных агентов

2) Приняв исходные величины деполяризации и сокращения за 100%, оценить влияние биологически активных веществ на уровень мембранного потенциала и мышечный тонус

3) Рассчитать эффект БАВ в % от действия исходного фактора.