Тема 22.1. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных онкогенными вирусами человека и вирусами иммунодефицита человека

План

Программа

Биологические свойства онкогенных вирусов. Вирус­ные и клеточные онкогены и антионкогены. Роль онкогенных вирусов в патогенезе злокачественных но­ вообразований человека.

Биологические свойства ВИЧ. Экология ВИЧ и эпи­демиология ВИЧ-инфекции, группы риска. Патоге­нез, диагностика, принципы профилактики и лечения ВИЧ/СПИД. СПИД-ассоциированные оппортунисти­ ческие инфекции.

а Задание студентам

Ознакомиться с бланками направлений на исследова­ние в вирусологическую лабораторию.

Указать материал для диагностики ВИЧ-инфекции.

Ознакомиться с тест-системами для серодиагностики ВИЧ-инфекции.

Оценить результаты серодиагностики ВИЧ-инфекции методом ИФА и наметить план дальнейшего обследо­вания.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных HPV

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазок-соскоб или биоптат из пораженного участка кожи или слизистой оболочки.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологический метод — обнаружение измененных клеток с признаками ЦПД (коилоциты).

Вирусоскопический метод — обнаружение зрелых вирусных частиц в зараженных клетках. Этот метод позволяет обнару­жить вирусы только в случае их репродукции. В опухолевых клетках присутствуют дефектные вирусы, не способные к реп­родукции.

Вирусологический метод — не применяют в связи со слож­ностью культивирования вируса.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические иссле­дования. Обнаружение вирусных антигенов в зараженных клетках методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. Обна­ружение вирусных ДНК в зараженных клетках — метод ДНК-зондов (ДНК-гибридизация in situ), ПЦР. Эти методы позво­ляют диагностировать латентную инфекцию и присутствие де­фектных вирусов.

Серодиагностика. С целью диагностики ЯРК-инфекции вы­являют антитела к белкам капсида и вирусным онкогенам.

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных BKV

и /СУ (см. главу 21 и главу 19 соответственно)

• Диагностика инфекций, вызванных HTLV

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Серодиагностика — обнаружение антител к вирусным бел­кам — применяют для выявления вирусоносительства и лабо­раторной диагностики тропического спастического паралича (см. также главу 19).

• Микробиологическая диагностика ВИЧ-инфекции

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, лейкоциты пе­риферической крови, пунктах лимфатических узлов и костного мозга. Вирус также может быть обнаружен в отделяемом сли­зистых оболочек генитального тракта, сперме, слюне, слезной жидкости, грудном молоке, спинномозговой жидкости, в труп­ном материале.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусологический метод (схема 22.1.1). Выделение вируса из крови и лейкоцитов в связи со сложностью культивирования в клинической практике используется редко. Основным пока­занием к применению является раннее обнаружение вируса у новорожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Вирус вы­деляют путем совместного культивирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови пациента с лейкоцитами здоровых доноров в присутствии IL-2 для стимуляции роста Т-лимфоцитов. ЦПД проявляется образованием синцития и лизисом зараженных клеток. Метод позволяет выявить латент­ную инфекцию. О присутствии вируса судят по результатам определения специфических антигенов ВИЧ (р24, обратной транскриптазы) в культуральной среде и зараженных клетках. Культивирование ВИЧ требует соблюдения специальных усло­вий безопасности при работе.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические иссле­дования. Обнаружение вирусных антигенов (р24) в крови и лимфоцитах с помощью ИФА. Следует учитывать, что р24 в достаточном для выявления количестве присутствует в крови только при первичной инфекции и на поздних стадиях забо­левания.

Молекулярно-биологические исследования. Об­наружение РНК вирусов в крови методом RT-ПЦР. Метод основан на преобразовании вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием фермента обратной транс­криптазы (RT) и амплификации полученной кДНК методом ПЦР — применяется для определения уровня вирусемии. Чув­ствительность метода позволяет обнаруживать вирус в малых концентрациях.

Серодиагностика. Обнаружение антител к вирусным антиге­нам (поверхностным белкам gp!20) — методы ИФА — приме­няют для массового обследования. В случае положительного результата с целью верификации осуществляют поиск антител к индивидуальным вирусным белкам методом иммуноблоттин-га, непрямой ИФ и другими методами.

Метод иммуноблоттинга ("вестерн-блот") — тестирование сыворотки на наличие антител против отдельных вирусных антигенов сердцевины и поверхностной оболочки ВИЧ. Вирус­ные белки с помощью электрофореза в вертикальном блоке полиакриламидного геля разделяют по молекулярной массе и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, где антитела сы­воротки реагируют с индивидуальными вирусными белками. Образующиеся иммунные комплексы выявляются авторадио-графически или с помощью ИФА.

Для косвенного подтверждения диагноза СПИД могут быть использованы методы оценки иммунного статуса: определение общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, соотношения CD4⁺/CD8⁺ Т-лимфоцитов, количества натуральных килле­ров, уровней сывороточных иммуноглобулинов. Для СПИД характерно развитие Т-клеточного дефицита: снижение коли­чества Т-лимфоцитов, преимущественно Т-хелперов CD4+ (менее 500/мм³), снижение уровня показателя CD4⁺/CD8⁺ ниже 1,0; уменьшение количества натуральных киллеров; уме­ренная поликлональная гипергаммаглобулинемия с увеличени­ем содержания IgG.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Тест-системы для диагностики ВИЧ/СПИД методом ПЦР.

Тест-системы для серодиагностики ВИЧ/СПИД методом ИФА.

Тест-системы для диагностики папилломавирусной инфек­ции методом ПЦР.

Противовирусные препараты:

Ингибиторы обратной транскриптазы: азидотимидин (AZT), ди-дезоксиинозин (DDI), дидезоксицитидин (DDC), невирапин и др.

Ингибиторы протеазы: саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир и др.

Препараты для иммунотерапии: интерферон человеческий лейкоцитарный; интерферон рекомбинантный.