Тема 14.2. Возбудители менингококковой инфекции, коклюша и дифтерии

План

Программа

1. Биологические свойства возбудителей менингококко-вой инфекции, коклюша и дифтерии; их патоген-

220

ность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

а Демонстрация

[.Приспособления и тампоны (простые, проволочные, сывороточные) для взятия материала из зева и носо­глотки.

2. Мазки для микроскопии.

Neisseria meningitidis — мазки из чистой культуры и спинномозговой жидкости, окраска по методу Грама и метиленовым синим.

BordeteНа pertussis — мазок из чистой культуры, ок­раска по методу Грама.

Corynebacterium diphtheriae:

мазок из чистой культуры, окраска по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру;

мазок из чистой культуры в люминесцентном микроскопе, окраска корифосфином.

Культура N.meningitidis на сывороточном агаре.

Обнаружение менингококкового антигена в спинно­мозговой жидкости в РИГА.

Колонии В.pertussis на казеиноутольном агаре (КУА) и среде Борде—Жангу.

Определение уреазной активности возбудителя паракоклюша.

PC К для серодиагностики коклюша.

Экспресс-диагностика коклюша с помощью иммунофлюоресцентного метода.

Рост коринебактерий на свернутой сыворотке и теллуритовой среде.

"Пестрые" ряды культур коринебактерий. Пробы на цистиназу и уреазу.

Определение токсигенности C.diphtheriae (реакция преципитации в агаре).

Ускоренный метод диагностики дифтерии.

а Задание студентам

Указать приспособления (виды тампонов) для взятия материала при менингококковой инфекции, коклюше и дифтерии.

Микробиологическое исследование при менингокок­ковой инфекции:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать готовые мазки из спинномозговой жидкости и носо­глотки, сделать заключение;

бактериологическое исследование и иммунохимический метод;

по результатам, полученным из лаборатории, сде­лать заключение.

3. Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюше:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать го­товые мазки из носоглотки. Сделать вывод и наме­тить план дальнейшего исследования;

бактериологический метод: по результатам, полу­ченным из лаборатории, сделать заключение.

4. Микробиологическое исследование при дифтерии:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать мазки из материала, взятого из зева лиц с подозре­нием на дифтерию или бактерионосительство, сде­лать предварительное заключение и наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения бактериоскопического диагноза;

бактериологический метод: описать рост культуры, полученной на свернутой сыворотке, и колоний на теллуритовой среде, отметить результаты готовых посевов исследуемых культур на средах "пестрого" ряда, в случае обнаружения C.diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактериоскопического и бактериологического исследований с целью идентификации выделенной культуры и поставить окончательный микробиологический диагноз.

5. Дать краткую характеристику диагностическим, про­филактическим и лечебным препаратам.

Методические указания

• Микробиологическая диагностика метнгококковой инфек­ции

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки, аспират из высыпных элементов.

При обследовании на носительство материал из верхних отделов носоглотки берут специальным носоглоточным тампо­ном (который на ³/4 Длины сгибают под углом 45°). При доставке в лабораторию его предохраняют от охлаждения и высушивания, поскольку менингококк очень чувствителен к воздействию этих факторов.

Спинномозговую жидкость берут в количестве 2—5 мл и делят на две части: одну центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдер­живают при 37 °С для накопления бактерий. Из исследуемого материала готовят мазки и производят посевы.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.1). Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Гра-ма и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве слу­чаев обнаруживаются типичные грамотрицательные диплокок­ки, имеющие характерное расположение внутри лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менинго-кокковой инфекции. При микроскопии мазков из носоглотки бактерионосителей наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные стафилококки и стрептококки, а также непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.). Дифференциро­вать их по морфологическим признакам не представляется возможным.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с питательным агаром, содержа­щим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость. В среды добавляют антибиотик ристомицин (150 ЕД/мл), который задерживает размножение грамположительных кок­ков, содержащихся в исследуемом материале, и тем самым способствует выделению чистой культуры менингококка. Образование колоний менингококка на этих средах наблю­дается через 48 ч после инкубации посевов при 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (3—10 %) и вы­сокой влажностью. В отличие от других кокков колонии ме­нингококка величиной с булавочную головку прозрачны, име­ют голубоватый оттенок и ровные края. Такие колонии пере­севают в пробирку со скошенным агаром для получения чистой культуры.

Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от сап­рофитных нейссерии, обитающих в носоглотке, проводят по ряду культуральных и биохимических признаков. Так, менин­гококк растет только в присутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии размножаются на простых средах и образуют пигмент; на средах Гисса с добавлением сыворотки крови менингококк ферментирует глюкозу и мальтозу до кис­лоты (табл. 14.2.1).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала использу­ют метод ИФ.

Признак N.men- N.gonor- N.sub- N.mu- M. catar-ingitidis rhoeae flava cosa rhalis Продукция каталазы + -*- + + + Продукция оксидазы + + + + + Образование пигмента ± ± + + + Рост при 22 °С ± ± + + + Потребность для роста + + ± ± ± в сыворотке или крови Образование кислоты при расщеплении углеводов: глюкозы + + + + ± лактозы ± ± ± [+} ± мальтозы + ± + ± ± сахарозы ± ± + ± ± Восстановление нитратов ± ± ± + ±

• Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у малень­ких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной про­волоке, вводят через нос.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.2). Бактерио-скопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод (см. ниже).

Бактериологическое исследование. Основной метод лабора­торной диагностики коклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом "кашлевых пластинок". Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80—90 % больных. Материал засевают на КУА или кровяные среды — картофельно-глицериновый кро­вяной агар (среда Борде—Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии В.pertussis на указан­ных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирова­ния. B.parapertussis — несколько раньше: через 24—72 ч. Борде-теллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серова­то-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жем­чужный или ртутный блеск. Колонии B.parapertussis более круп­ные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотри-цательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглюти­нации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальней­шего изучения чистых культур.

Идентификацию выделенной культуры производят на осно­вании комплексного изучения морфологических, культураль-ных, биохимических и серологических свойств (табл. 14.2.2). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питатель­ных сред.

Признак В. per- В. parapertussis В. bron-tussis chisep-tica Рост: на агаре (простом) — + 4-— Коричневая окраска на агаре с тирозином + + Ярко-коричневая окраска Изменение окраски: КУА — Буро-коричневая — кровяного агара — Потемнение — Образование уреазы + + + Наличие антигенов: родового (общего) 777 видового (специфического) 1 14 12

люшными антителами, другой — паракоклюшными антитела­ми. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроско­пе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериаль­ных клеток с четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3—4^й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вак­цинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.

• Микробиологическая диагностика дифтерии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и но­соглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампо­нами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.3). Мазки ок­рашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно нали­чие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V" (см. рис. 2.2.4). Corynebacterium pseudodiphth-eriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследова­ния. При этом C.diphtheriae можно отличить от других корине-бактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом кори-фосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфоло­гию, в частности при санации зева антибиотиками. В настоя­щее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицатель-ных результатов).

Бактериологическое исследование. Является ведущим мето-

дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, гли­церином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделен­ных бактерий tox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом оп­ределения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, явля­ются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 "С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения ток­сина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — "усов" (см. рис. 10.1.7).

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфоло­гическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углево­дов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с

Вид Ферментация (2 ^ « 1 s 8 s 5 Р i 1 1 1 1 _ С в о Я « в s яб"-0-? II 1 1 | 1 1 1 | iSlI л! ^ е 1 s- (2 я ^ Ilig C.diphlheriae биовар ^rav/5 + — — + + + +— + биовар mitis + + — + — ± + — + C.xerosis ± _ + + — — ±— — C.pseudodiphtheriticum ± ______+ _

Применяют для обнаружения антигенов N.meningitidis в спин­номозговой жидкости в РИГА.

Коклюшная вакцина. Содержит взвесь В.pertussis, убитых формалином. Применяют для обязательной активной специ­фической профилактики коклюша. Входит в состав АКДС (ад­сорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), которая включает также очищенные концентрированные диф­терийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидрате оксида алюминия.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получен из пла­центарной или венозной крови человека. Содержит специфи­ческие антитела против возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. Применяют для создания пассивного иммунитета с целью профилактики и лечения коклюша.

Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки. Применяют для серологической дифференциации возбудите­лей коклюша.

Дифтерийный адсорбированный очищенный анатоксин (АД). Дифтерийный экзотоксин обезвреживают формалином при на­гревании, а затем очищают от балластных веществ, концент­рируют и адсорбируют на гидрате оксида алюминия. Приме­няют для профилактики дифтерии путем создания активного иммунитета. Входит в состав адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС) и АКДС.

Противодифтерийная антитоксическая сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным ана­токсином, очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность сыворотки изменяется в международных единицах. Применяют для экстренной профилактики и лечения дифте­рии за счет создания пассивного иммунитета.

Агглютинирующая противодифтерийная сыворотка (полива­лентная и типовые). Применяют для дифференциации C.diph-theriae от дифтероидов.

Антимикробные препараты: пенициллин и другие р-лактамы, хлорамфеникол, рифампицин, сульфаниламиды, тетрациклин, эритромицин.