Часть I

ОБЩАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

Глава 1

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИИ ИХ ОБОРУДОВАНИЕ

Введение. Все микробиологические, биохимические и моле-кулярно-биологические исследования микроорганизмов про­водят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования (бактерий, вирусов, грибов, простейших), а также от их целевой направленности (научные исследования, диагностика заболеваний). Изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных осуществляют в иммунологических и серологичес­ких (serum — сыворотка крови) лабораториях.

Бактериологические, вирусологические, микологические и серологические (иммунологические) лаборатории входят в со­став санитарно-эпидемиологических станций (СЭС), диагнос­тических центров и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняют бактериологические, вирусологические и серологи­ческие анализы материалов, полученных от больных и контак­тировавших с ними лиц, обследуют бактерионосителей и про­водят санитарно-микробиологические исследования воды, воз­духа, почвы, пищевых продуктов и т.д.

В бактериологических и серологических лабораториях боль­ниц и диагностических центров проводят исследования с целью диагностики кишечных, гнойных, респираторных и дру­гих инфекционных заболеваний, осуществляют микробиологи­ческий контроль за стерилизацией и дезинфекцией.

Диагностику особо опасных инфекций (чума, туляремия, сибирская язва и др.) проводят в специальных режимных ла­бораториях, организация и порядок деятельности которых строго регламентированы.

В вирусологических лабораториях диагностируют заболева­ния, вызванные вирусами (грипп, гепатит, полиомиелит и др.), некоторыми бактериями — хламидиями (орнитоз и др.) и рик-кетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.). При организации и оборудовании вирусологических лабораторий учитывают спе­цифику работы с вирусами, культурами клеток и куриными эмбрионами, требующую строжайшей асептики.

В микологических лабораториях проводят диагностику за­болеваний, вызываемых патогенными грибами, возбудителями микозов.

Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещени­ях, площадь которых определяется объемом работ и целевым назначением. В каждой лаборатории предусмотрены:

а) боксы для работы с отдельными группами возбудителей;

б) помещения для серологических исследований;

в) помещения для мойки и стерилизации посуды, приготов­ления питательных сред;

г) виварий с боксами для здоровых и подопытных живот­ных;

д) регистратура для приема и выдачи анализов.

Наряду с этими помещениями в вирусологических лабора­ториях имеются боксы для специальной обработки исследуе­мого материала и работы с культурами клеток.

Оборудование микробиологических лабораторий. Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов.

Приборы для микроскопии: биологический иммерсион­ный микроскоп с дополнительными приспособлениями (ос­ветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный кон­денсор и др.), люминесцентный микроскоп.

Термостаты и холодильники.

Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистил­лятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппара­тура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.

Набор инструментов для манипуляций с микробами: бак­териологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.

Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых про­ бок.

Крупные диагностические комплексы имеют автоматичес­кие анализаторы и компьютеризированную систему оценки полученной информации.

В лаборатории выделено место для окраски микроскопичес­ких препаратов, где находятся растворы специальных красите­лей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и емкостью с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми пита­тельными средами, химическими реактивами, диагностически­ми препаратами и другими материалами.

В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты Для массового выращивания микроорганизмов, постановки се­рологических реакций. Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей используют следующую аппаратуру.

Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоян­ная температура. Оптимальная температура для размножения большинства патогенных микроорганизмов 37 °С. Термостаты бывают воздушными и водяными.

Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

СО₂ -инкубатор. Аппарат для создания постоянной тем­пературы и атмосферы определенного газового состава. Пред­назначен для культивирования микроорганизмов, требователь­ных к газовому составу атмосферы.

Холодильники. Используют в микробиологических лабора­ториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически актив­ных препаратов при температуре около 4 "С. Для хранения препаратов при температуре ниже О °С применяют низкотем­пературные холодильники, в которых поддерживается темпе­ратура -20 °С или -75 'С.

Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганиз­мов, эритроцитов и других клеток, для разделения неоднород­ных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях исполь­зуют центрифуги с различными режимами работы.

Сушилъно-стершшзационный шкаф (печь Пастера). Предназначен для суховоздушной стерилизации стеклянной лабо­раторной посуды и других жаростойких материалов.

Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для сте­рилизации перегретым водяным паром (под давлением). В ми­кробиологических лабораториях используют автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, пере­носные).

Тема 1.1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, МИКОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. УСТРОЙСТВО СОВРЕМЕННЫХ МИКРОСКОПОВ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

План

Программа

Правила работы и организация микробиологических (бактериологических, вирусологических, микологи­ческих) лабораторий.

Основные приборы и оборудование микробиологичес­кой лаборатории.

Микроскопы и микроскопическая техника. Правила работы с иммерсионным микроскопом (объективами).

а Демонстрация

Устройство и применение основных приборов и обо­рудования, используемого в микробиологических ла­бораториях: термостата, центрифуг, автоклава, су­шильного шкафа, инструментария и посуды.

Устройство биологического микроскопа. Различные ме­тоды микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная.

Препараты микробов (дрожжей и бактерий) при различных методах микроскопии.

Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать препараты дрожже-подобных грибов рода Candida, используя различные виды микроскопии.

Методические указания

Правила работы в микробиологических лабораториях. Работу в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводят с возбудителями инфекционных заболеваний — пато­генными микроорганизмами. Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутрен­него распорядка.

Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых слу­чаях работающие надевают на лицо маску из марли. Ра­бота с особо опасными микробами регламентируется спе­циальной инструкцией и проводится в режимных лабора­ториях.

В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

Рабочее место должно содержаться в образцовомпорядке. Личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.

При случайном попадании инфицированного мате­риала на стол, пол и другие поверхности это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раство­ром.

Хранение, наблюдение за культурами микробов и их уничтожение должны производиться согласно специаль­ной инструкции. Культуры патогенных микробов реги­стрируют в специальном журнале.

По окончании работы руки следует тщательно вы­мыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют не­сколько типов микроскопов (биологический, люминесцент-

увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, уве­личение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуля­ром 10 составляет: 90x10=900.

Микроскопия в проходящем свете (светлопольная микроско­пия). Используется для изучения окрашенных объектов в фик­сированных препаратах.

Темнопольная микроскопия. Применяется для прижизненно­го изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 1.3). При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светя­щиеся частицы. Препарат в этом случае имеет вид, показанный на рис. 1.4, б (на вклейке).

Фазово-контрастная микроскопия. Предназначена для изуче­ния нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособле­ние дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объек­ты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое глазом. Фазовое устройство, вклю­чающее особые конденсор и объектив, обеспечивает преобра­зование изменений фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различия в оптической плотности объектов. Они приобретают высокую контрастность, которая может быть позитивной или негатив­ной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изо­бражение объекта в светлом поле зрения, негативным — свет­лое изображение объекта на темном фоне (см. рис. 1.4; на вклейке).

Для фазово-контрастной микроскопии используют обыч­ный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устрой­ство КФ-1 или КФ-4 (рис. 1.5), а также специальные освети­тели.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее под воздействием внешнего излучения: светового, ультрафиолето­вого, ионизирующего и др. Фотолюминесценция — люмине­сценция объекта под влиянием света. Если освещать люминес-цирующий объект синим светом, то он испускает лучи крас­ного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Длина волны излуча-

Наряду с приборами "просвечивающего" типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рель­ефное изображение поверхности объекта. Разрешающая спо­собность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов "просвечивающего" типа.

Правила работы с микроскопом. Работа с любым световым микроскопом включает установку правильного освещения по­ля зрения и препарата и его микроскопию различными объек­тивами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света — осветители разных марок.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:

на приготовленный на предметном стекле и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

повернуть револьвер до отметки иммерсионного объек­тива 90х или 100х;

3) осторожно опустить тубус микроскопа до погруженияобъектива в каплю масла;

установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

провести окончательную фокусировку препарата микро­метрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с пре­паратом, так как это может повлечь поломку покровного стек­ла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

По окончании работы микроскопа необходимо удалить мас­ло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии ис­пользуют нативные препараты ("раздавленная" капля и др., см. тему 2.1); микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1,5 мм, покров­ных – 0,15-0,2 мм.