- •Часть I. Общая медицинская микробиология, вирусология и иммунология
- •Часть I
- •Глава 1
- •Глава 2
- •Тема 2.1. Изучение морфологии бактерий и их тинкториальных свойств. Простые методы окраски
- •Тема 2.3. Морфологические особенности
- •Глава 3
- •Тема 3.2. Идентификация бактерий
- •Глава 4
- •Глава 5
- •Тема 5.1. Морфология и структура вирусов. Вирусоскопические методы исследования
- •Тема 5.2. Культивирование вирусов и других облигатньгх внутриклеточных паразитов (риккетсий, хламидий)
- •Тема 6.1. Модификационная изменчивость, мутации, рекомбинация и перенос генов между бактериями
- •Глава 7 методы стерилизации.
- •Тема 7.1. Методы оценки антимикробного действия химических и физических факторов
- •Тема 7.2. Методы оценки эффективности действия антимикробных препаратов
- •Глава 8
- •Тема 8.1. Микрофлора воды, воздуха и почвы. Методы санитарно-бактериологического исследования воды, воздуха и почвы
- •Тема 8.3. Микрофлора организма человека
- •Глава 10
- •Тема 10.2. Методы количественного определения специфических антител (серодиагностика)
- •Тема 10.3. Методы оценки иммунного статуса организма человека
- •Тема 10.4. Методы оценки клеточного и гуморального иммунного ответа. Вакцины. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины
- •Часть II
- •Глава 11
- •Тема 11.1. Методы клинико-диагностических микробиологических исследований и оценка полученных результатов
- •Глава 12
- •Тема 12.1. Аэробные бактерии -возбудители гнойно-воспалительных заболеваний и раневых инфекций
- •Тема 12.2. Анаэробные бактерии - возбудители гнойно-воспалительных и раневых инфекций
- •Глава 13
- •Тема 13.2. Возбудители брюшного тифа, паратифов и иерсиниозов. Дисбактериоз
- •Тема 13.3. Возбудители пищевых
- •Глава 14
- •Тема 14.2. Возбудители менингококковой инфекции, коклюша и дифтерии
- •Тема 14.3. Возбудители туберкулеза, проказы и актиномикоза
- •Тема 15.1. Возбудители сифилиса и мягкого шанкра
- •Тема 15.2. Возбудители гонореи, урогенитального хламидиоза, микоплазмоза и уреаплазмоза
- •Глава 16
- •Тема 16.1. Возбудители чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза и других зоонозных инфекций
- •Глава 17
- •Глава 18
- •Глава 19
- •Тема 20.1. Микробиологическая диагностика кишечных вирусных инфекций и вирусных гепатитов
- •Глава 21
- •Тема 21.1. Микробиологическая диагностика вирусных поражений кожи, слизистых оболочек, лимфоидной и железистых тканей
- •Глава 22
- •Тема 22.1. Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных онкогенными вирусами человека и вирусами иммунодефицита человека
- •Глава 23
- •Глава 24
- •Тема 24.1. Микробиологическая диагностика протозойных инфекций
Тема 6.1. Модификационная изменчивость, мутации, рекомбинация и перенос генов между бактериями
План
Программа
Способы сохранения генетической информации у микробов.
Модификационная изменчивость.
Мутационная изменчивость.
Рекомбинация ДНК.
Способы передачи генетической информации между бактериями — трансформация, трансдукция, конъюгация.
Фаговая конверсия.
Сохранение и изменение генетической информации в микробных популяциях.
Демонстрация
S- и R-формы колоний у E.coli.
Таблицы со схемами передачи генетической информации между бактериями в опытах трансформации, трансдукции и конъюгации.
Задание студентам
Определить частоту образования рекомбинантов Leu+ в опыте конъюгации.
Определить частоту образования трансдуктантов (рекомбинантов) в опыте трансдукции фагом A, dgai
Определить частоту образования трансформантов (рекомбинантов) в опыте трансформации признака Strr (стрептомицинрезистентности) у Bacillus subtilis.
Методические указания
Постановка опыта трансформации (рис. 6.1; на вклейке). Реципиент — штамм Bacillus subtilis Str5 (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину); донор — ДНК, выделенная из
штамма B.subtilis Strr (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина. К 1 мл бульонной культуры B.subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида натрия готовят 10-кратные разведения до 10~5— 10~6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинант-ных клеток к числу клеток реципиентного штамма.
Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10~5 выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170хЮ5 жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170хЮ6, или 1,7х108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинант-ных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8x10^. Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:
Постановка опыта специфической трансдукции (рис. 6.2; на вклейке). Реципиент — штамм E.coli lac, лишенный (3-галакто-зидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг Я. dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактозидазным опероном E.coli. Он является дефектным, т.е. не способен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Селективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозо-положительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 106—107 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10~6 делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение 1 сут, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.
Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10"~6 на 3 чашках со средой Эндо выросло соответственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках — 5 и 1 колонии трансдуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:
(5+1) х 10xlO<J = 6 2
(38+170+160) х 10х10б 468 '
Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, который содержит ген leu, контролирующий синтез лейцина (рис. 6.3; на вклейке). Донор — штамм E.coli K12 Hfr leu+ Str5; реципиент — штамм E.coli K12F~ leu+ StrR. .Hfr — обозначение состояния, для которого характерна высокая частота рекомбинации. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда: КН^РС^ — 6,5 г, MgSO4 - 0,1 г, (NH4)2S04 - 1 г, Ca(NO3)2 - 0,001 г, FeSO4 -0,0005 г, глюкозы — 2 г, стрептомицина — 200 ЕД/мл, дистиллированной воды — 1 л.
К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2—10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорныи и реципиентныи штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. Например, после посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных культур в разведении 10~2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10~6 — 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:
150 х 10 х 100 _ 1,5 х 10s _4
75х10хЮ6 ~7,5хЮ8 ' '