19. Методы цито- и гистологических исследований

На современном уровне биологии клетки существует 2 подхода изучения: дискретный (изучаются отдельные органоиды) и интегративный (рассматривает клетку, как часть целого)

- Дискретный подход включает следующие методы:

1. Изучение отдельный органоидов (методы биохимии – выделение отдельных молекул)

2. Методы экспериментальной физиологии (изучение различных функций)

3. Культура клеток (получают клеточный материал и воздействуют разными биохимическими агентами)

4. Гибридизация на уровне клеток и на уровне органелл

- Интегративный подход: 1. Сравнительно-цитологические методы позволят выбрать из большого количества одно- и многоклеточных удобные цитологические объекты. Среди удобных объектов пытаются найти те узловые механизмы или конструкции, которые определяют их эволюцию и стабильность.

2. Сравнительный метод по принципу гомологии (исследование одноклеточной системы организмов)

3. Сравнительный метод по принципу функциональной аналогии (изучение внутренних закономерностей в рамках клеточной организации при наличии жестких ограничений на субклеточном уровне.

….ЕЩЕ ДОБАВЛЮ….

20. Методы микротехники

Метод приготовления фиксированного и окрашенного препарата, для этого необходимо:

- взятие и фиксация материала

- уплотнение материала и приготовление и срезов

- окрашивание и заключение материала в бальзам или другие среды

Суть: мелких животных умертвляют дакопитацией, либо усыплением с помощью эфира или хлороформа. Для фиксации берут паренхиматозные органы (печень, сердце, почки, селезенка), от мелких животных берут их целиком, надсекая при этом соединительно-тканую капсулу в нескольких местах. Для цитологических исследований органы разрезают на мелкие кусочки. Из паренхиматозных органов крупных животных и человека также вырезают кусочки (величина кусочка – по длине 10 -15мм, по ширине 5 – 10мм, по толщине 3 – 4мм).

Фиксация производится для сохранения тканей и органов в том состоянии, в котором они были к моменту смерти животного. В процессе фиксации в тканях происходят сложные физико-химические изменения (свертывание, коагуляция белков). Наименьшее раздражающее действие на ткани оказывает четырехокись осмия. Иногда прибегают к замораживанию фиксируемого материала – если ткань или вещества легко разрушаются или вымываются. Сначала проводят промывание фиксируемого материала в физ.растворителях.

Фиксаторы делятся:

- простые (обезвоживающие вещества) – этиловый спирт, метиловый спирт, ацетон, формалин

- сложные (состоят из смеси) – жидкость Ценкера, жидкость Буена и др.

Чаще всего проводят промывку в проточной воде или в спиртах различной концентрации. Промывка обеспечивает первоначальное очищение материала от фиксатора и осадков. Обычно после фиксации в простых фиксаторах для промывки используют проточную воду, а после фиксации в смесях – спирты.

Обезвоживание проводят с помощью набора спиртов повышающейся концентрации (40, 50, 60,70, 80, 90 градусов). При обезвоживании материал последовательно переносят из спирта в спирт, время пребывание материала в спирте зависит от вида ткани и размеров объекта (от 1-2 часов до 1-2 суток).

заливают парафином в формочки. А после его застывания делают гистологические срезы. Срезы окрашивают. Первоначально избавляясь от парафина (отмывают срезы в ксилоле или бензоле). Для окрашивания используют основные красители (гематоксилин) – окрашивание ядер клеток, кислые красители (эозин) – окрашивают протоплазму. Чаще всего используют смесь красителей. Например, для окрашивания среза в гематоксилин-эозине сначала помещают его в гематоксилин на 2-3 мин, затем в дистиллированную воду, затем в растров соляной кислоты в спирте для смягчения окраски, снова в воду, затем в щелочь, снова в воду, далее в раствор эозина, потом дист.вода, обезвоживание в спирте, капля бальзама для просветления и сохранности препарата.

22. Методы выделения и исследования субклеточных структур.

….ЕЩЕ ДОБАВЛЮ….