26. Кинетические методы анализа

Кинетические методы анализа - методы качественного и количественного химического анализа, основанные на зависимости между скоростью реакции и концентрацией реагирующих веществ. К. м. а. можно применять для определения как сравнительно больших, так и малых количеств вещества; в последнем случае используют каталитические реакции, в которых определяемое вещество может расходоваться в процессе реакции или служить её катализатором. Чувствительность К. м. а., основанных на таких реакциях, сравнима с чувствительностью активационного анализа. Например, с помощью каталитических реакций можно определить Mn и Со при концентрации их ионов соответственно 10^-5 и 10^-6 мкг/мл. Реакцию, по скорости которой определяют концентрацию, называют индикаторной. Обычно применяют реакции следующих типов: окислительно-восстановительные (например, окисление в щелочной среде Mn²⁺ в MnO₄^- гипобромитом); реакции изотопного обмена между одноимённо заряженными ионами (например, Ce⁴⁺ — Ce³⁺); реакции замещения во внутренней сфере комплексных соединений [напр., замещение CN^- в Fe (CN)₆^4- водой]; различные гетерогенно-каталитические реакции и  др. Скорость реакций измеряют титриметрическим, газоволюметрическим, фотометрическим, полярографическим, потенциометрическим и другими методами. При выполнении измерений необходимо тщательно термостатировать реакционные сосуды и применять реагенты высокой чистоты, т.к. скорость каталитических реакций сильно зависит от температуры, присутствия посторонних веществ и др. факторов. К. м. а. используют главным образом для определения содержания примесей в полупроводниковых элементах, микроэлементов в биологических объектах, грунтовых водах, а также при анализе высокочистых реактивов и материалов.

28. Методы изучения ферментативной активности.

Ферменты по скорости катализируемой химической реакции разделяют на: медленные, средние и быстрые.

2 единицы активности ферментов:

1. 1961 г. международная единица – количество фермента, которое катализирует в оптимальных условиях (температура и рН) превращение 1 микромоль субстрата за 1 мин.

1 Мкмоль/мин м.Е. (международная единица)

2. 1973 г. количество фермента, которое катализирует в оптимальных условиях (температура и рН) превращение 1 моль субстрата за 1 сек.

1 межд.ед = 1

Если известно количество белка в препарате, то измеряется удельная активность. Это число микромоль субстрата превращаемого за 1 мин 1 мг фермента.

Если известна молекулярная масса, то можно измерить молекулярную ферментную активность.

Молекулярная активность – это число молей субстрата, превращенных в 1 мин одной молекулой фермента (т.н.число оборотов)

Активность ферментов можно изучить, изучая кинетику ферментативных реакций, т.е. сколько субстрата уменьшилось или фермента прибавилось.

Методы.

1. Адсорбционная спектроскопия (ФЭК, СЭФ)

2. Спектрофлюорометрический (по изменению флюоресценции)

3. Другие методы ФХА (полярография, потенциометрия, вискозиметрия)

4. Энзимэлектрофорез в ПААГ (можно измерить концентрацию фермента; прибор для измерения интенсивности поглощения ферментами электромагнитного излучения при сканировании ПААГ называется денситометр. Интенсивность поглощения отображается в виде пиков, и уже по площади пиков можно судить о количестве ферментов)

5. Измерения константы Михаэлиса.

V

КМ

ν

V

S

– максимальная скорость

ν- число молей субстрата в единицу времени

КМ-константа Михаэлиса

Константа Михаэлиса показывает сродство фермента к субстрату. Численно равна той концентрации субстрата, при которой скоростью ферментативной реакции составляет ½ от мах. скорости.