21. Методы культивирования протопластов, клеток и тканей.

Биотехнология – это использование живых организмов (в основном м/о) и биологических процессов для нужд человека ( в том числе производстве) /урванцева/

Биотехнология – использование живых организмов и биологических процессов в производстве /маракаев/

Преимущества фитобиотехнологии:

1.низкая энергоемкость

2. безотходность

3. экологическая чистота

4. использование стандартного оборудования и препаратов

5. возможность проведения исследования весь год, независимо от климатических условий

6. использование незначительной площади при проведении исследования

7. стандартизованное и более высокое качество сырья

8. возможность автоматизации технологических процессов

МЕТОДЫ

1. Культуры тканей и клеток (Каллусные культуры и Суспензионные культуры)

2. Культивирование отдельных клеток

3. Культура изолированных протопластов

4. Клональное микроразмножение растений

5. Генетическая инженерия растений

КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ (каллусные и суспензионные)

Культура ткани растения- это выращивание in vitro стерильных искусственных условиях изолированных клеток, тканей, органов и частей.

Они позволяют изучить биохимические, физиологические процессы на уровне автономных клеток без влияния целого организма.

Этапы:

1. Вычленение экспланта (кусочек ткани растения = 1 см)

2. Помещение экспланта на питательную среду и инкубирование его в определенных условиях.

3. Образование первичного каллуса (до 2 месяцев)

4. Изолирование каллуса и перенос его на свежую питательную среду (пассажи). Периодизация пассажей зависит от скорости роста биомассы и от конкретных задач

5. Субкультивирование тканей на различных средах:

• Твердые агаризованные среды - получение каллусной культуры

• В жидкой суспензии - суспензионные культуры

Способы культивирования тканей:

1. На агаризованных питательных средах. Получают ткань как скопление недифференцированных клеток. В каллусной культуре есть структура.

2. На жидкой питательной среде. Нет структуры, суспензия клеток.

3. Сочетание жидкой и питательной среды

4. Твердый субстрат поддерживает тканевую массу на поверхности питательной среды (полиакрилгель, например)

Этапы культивирования:

1. взять эксплант – наименышее количество паренхимных клеток, механической, проводящей ткани и меньше воздушных полостей)

2. стерилизовать (сулима, пероксид водорода, этанол, перманганат калия) если в ткани живут микроорганизмы необходимо избавиться от них - антибиотики

3. приготовление питательной среды (набор макроэлементов, углеводов, фитогормонов, витамины, органические вещества, экстракты растений). Проавтоклавировать среду.

4. Создать условия культивирования

• Свет, могут расти в темноте или при рассеянном свете

• Влажность, 60-70%

• Температура, 25-26 градусов, при органогенезе- 18-20

• Подбор условий индивидуален от вида и от получения продукта

• Ростовая кривая каллуса (в лекции)

5. Дифференцировка и каллусогенез.

Когда масса клеток образуется, то начинается этап дифференцировки in vitro. Данный этап очень важен для практики, так идет значительное накопление вторичных продуктов в разных частях. Например, люпин накапливается в корнях.

Дифференцировка - к состоянию делящейся клетки.

Особенности дифференцировки:

1. Ауксины вызывают переход из R в S фазы (клеточный цикл)

2. Цитокинины необходимы для завершения S фазы

3. Стимулируется синтез всех форм РНК

4. Исчезают транспецифичные белки-антигены

5. Появляются белки, специфичные для делящейся клетки и каллусных тканей

6. Прекращаются митозы

7. Увеличивается объем клеток, и теряется характерна форма клетки

8. Изменение структуры ядра и цитоплазмы

Возможна цитодифференцировка (капли жира, формирование пластид, образование везикул, образование вакуолей).

6. Конечный этап – формирование целого организма (растение0регенерант), из семян - сеянец.

7. Селекция в культуре тканей. Необходимо для отбора наиболее ценных материалов, где больше синтез вторичных метаболитов.

Методы селекции:

• Отбор форм, оказавшиеся наиболее эффективными ( другая окраска, клетки крупнее)

• Селекция колонии определенного морфологического типа

• Селекция мутантов, устойчивых к токсическому предшественнику

• Выделение ауксотрофных мутантов

• Получение мутантов, устойчивых аналогам аминокислот

• Получение штаммов путем обработки клеток химическими веществами, индуцирующие увеличение плоидности

• Селекция устойчивых рекомбинантных штаммов

Особенности каллусных клеток:

1. Не имеют строго определенной анатомической структуры

2. Цвет зеленоватый, желтоватый коричневатый

3. Происхождение и условия выращивания определяют характер ткани

4. При длительном культивировании они теряют пигментацию и становятся более рыхлыми

5. Клетки в каллусной культуре проходят обычный онтогенез

6. Химический состав каллусной ткани и ткан организма, как правило, различаются

7. Используют данную культуру для сохранения в растущем состоянии коллекции штаммов линии мутантов, получение суспензии клеток и для регенерации растения.

СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ

Берут каллусную клетки и помещают в жидкую среду, ставят на мешалку.

Особенности суспензионной культуры:

1. Клетки культивируются в жидкой среде, во взвешенном состоянии( не контактируют с другими клетками)

2. Культивироваться могут как отдельные клетки, так и небольшие группы или агрегаты клеток

Этапы:

• Взять каллусную ткань(2-3 г) и поместить в жидкую питательную среду

• Перемешать на качалке

• Провести серию субкультивирования

• Выращивают культуру в системе (открытая, закрытая) с режимом (периодический, проточный)

Что дают суспензионные культуры - (получают самые разные химические соединения и синтез вторичных метаболитов)

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

Источники клеток: 1. Клеточные суспензии

2.за счет мацерации тканей растения (из мезофилла листа)

3.изолированные протопласты

1. выделение клеток из суспензии:

• Используют микроманипуляторы.

• Часто путем последовательных разбавлений (фильтрование клеточной суспензии).

Необходимо чтобы клетки на питательной среде только росли, а не делились. Это выполняется двумя способами: выращивание с помощью «кормящего слоя» и использование «ткани-няньки».

2.культура изолированных протопластов

Протопласты - ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды и характерной структурной целостностью и способных осуществлять активный метаболизм, выполнять биосинтез трансформацию энергии.

Способы выделения протопластов:

• Механический (плазмолизирование клеток или снимается эпидермис с поверхности органа и протопласты выходят в среду) – можно выделить только небольшое число протопластов, длительный и трудоемкий и тд.

• Энзиматический (используют растворы ферментов) – ряд преимуществ, но необходим индивидуальный подбор ферментов

Этапы:

• Отделение экспланта

• Стерилизация

• Промывка в стерильной воде

• Снимается эпидермис, режут на кусочки и обрабатывают ферментами

• Очищают от остатков ткани (фильтрование с центрифугированием или метод флотации)

Культивирование либо методом жидких капель или методом платирования.