40. Гибридомная технология получения моноклональных антител.

Урванчик! Все вспомнили, как она нам на лекции желтую прессу читала, и улыбнулись =))

В 1975 г Келер и Мильштейн предложили гибридомную технологию получения в лаборатории моноклональных антител. В 1084 г они получили Нобелевскую премию за получение гибридомов – искусственные иммунокомпетентные клетки животных, работающие вне организма сколь угодно долго и производящие в неограниченном количестве моноклональные антитела.

Принцип получения – в основе метода слияние соматических клеток с последующим выделением и наработкой, культивированием необходимого клона клеток. Клон – группа генетически идентичных клеток, возникающие неполовым путем от общего предка.

Для этого берут смертные клетки иммунных лимфоцитов, выделенных из селезенки иммунизированного животного, и сливают их с «бессмертными» раковыми клетками (миеломными). Эти клетки интенсивно размножаются в лаборатории без всякого внешнего стимула. У этих клеток есть редкая особенность: в их цитозоле отсутствует фермент гипоксантинфосфорибозилтрансфераза, необходимый для переработки и усвоения гипоксантина. Это дополнительный (резервный) путь синтеза пуриновых азотистых оснований, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот и, соответственно, белков. Гипоксантин – яд для этих клеток. Зато у них, как у всех живых организмов, функционировал основной путь синтеза пуриновых оснований. Однако, этот путь можно блокировать противоопухолевым препаратом аминоптерином. Итак, гибридомы наследуют признаки обоих родителей: они способны синтезировать и выделять в окружающую среду антитела, содержат фермент гипоксантифосфорибозилтрансферазу и могут прекрасно развиваться на среде с гипоксантином. От раковых клеток они наследуют способность к безудержному и бесконтрольному росту и размножению.

Этапы:

1. Антитела, синтезируемые гибридомами, могут быть наработаны в неограниченном количестве. Они моноклональны и идентичны по всем параметрам и взаимодействуют только с одной антигенной детерминантой. Мышей интенсивно иммунизируют антигеном: белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Через 3 дня берут селезенку и лимфатические узлы и из них готовят взвесь клеток (иммунных лимфоцитов);

2. Эти клетки сливают с раковыми (миеломными) клетками, добавляя полиэтиленгликоль для растворения поверхностных мембран клеток. При этом получают гибридомы с выходом 50%.

3. Отбор гибридом или освобождение от не слившихся родительских клеток. Для этого клетки культивируют в среде ГАТ, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Миеломные клетки погибают через несколько дней из-за неспособности синтезировать пуриновые основания. Лимфоциты селезенки погибают, т.к. не способны поддерживать свое существование вне организма. Сл-но, выживают только гибридомы.

4. Клонирование и отбор нужных клонов антител. Выжившие в среде ГАТ клетки рассевают в специальные 96-луночные пластиковые планшеты. В каждую лунку помещают по 10 гибридомных клеток и культивируют их в присутствии «кормящих» клеток, способствующих их росту. После культивирования в течение нескольких дней проверяют клетки на присутствие нужных антител с помощью ИФА.

5. Реклонирование клеток из лунок с нужными антителами. Для этого их повторно рассевали по таким же лункам планшета, но из расчета 1 клетка на лунку и проверяли на наличие необходимых моноклональных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза.

6. Наработка моноклональных антител (субкультивирование):

• культивируя клетки в неограниченном количестве нарабатывая моноклональные антитела и затем храня их при -70.

• Другой способ наработки антител связан с тем, что полученные клетки вводят внутрибрюшинно мышам, вызывая развитие у мышей опухолей, а через 10-14 дней в асцитной жидкости каждой мыши 8-9 мл моноклональных антител. Делая пересевы от мыши к мыши можно наработать моноклональные антитела. Они настолько однородны, что могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Применение моноклональных антител.

1. Для определения биологически активных веществ: белков крови, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, бактериальных и вирусных антигенов. Созданы очень чувствительные диагностикумы на твердой фазе: на чуму, холеру, вирусные заболевания растений.

2. Гибридомы применяются как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением. Можно получить огромное количество антител к уникальному антигену, затерянному среди других компонентов как иголка в стоге сена.

3. В онкологии для диагностики опухолей. Можно установить биохимическую природу антигенной мишени, т.е. причину заболевания.

4. В качестве переносчиков лекарств в опухолевые клетки.

5. В фундаментальной и прикладной иммунологии. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний.

6. Моноклональные антитела эффективно используют для профилактики многих заболеваний. Например, раньше вакцину от бешенства вводили людям в брюшную полость (40 болезненных уколов). Сейчас делают 4 укола в руку.

7. Моноклональные антитела используют при трансплантации органов и тканей для предотвращения их отторжения. При этом они связывают Т-лимфоциты, которые образуются на трансплантированный орган или ткань.

8. Для выделения и очистки белков и других биологически активных соединений. Например, с помощью моноАТ в 5000 раз очищен интерферон из грубого клеточного экстракта.