17. Токсикологические методы исследования

Токсиколо́гия— наука, изучающая ядовитые(токсичные) и вредные вещества, потенциальную опасность их воздействия наорганизмыи экосистемы, механизмы токсического действия, а также методы диагностики, профилактики илеченияразвивающихся вследствие такого воздействиязаболеваний.

Условно все методы, используемые токсикологии, могут быть разделены на методы химико-аналитические, биотестирования и биоиндикации. Для исследования общетоксикологических закономерностей применяются разнообразные методы практически из любой сферы биологии и смежных научных областей, обобщающей основой которых оказывается воздействие химического агента на систему биологического происхождения. Это может быть биохимическая система, выделенный элемент клеточной структуры или орган, функциональные или структурные элементы целого организма, выборки, популяции и сообщества организмов. Степень изменения каждого из параметров, определенного биохимическими или биофизическими методами, с использованием микроскопической или электрометрической техники, визуальными или вычислительными методами может служить показателем токсического действия.

Ассортимент функций и реакций, используемых для оценки токсичности разнообразных веществ и применяемых в контроле качества среды, связан с различными уровнями биологической организации. В связи с этим для каждого из уровней могут быть выделены частные и интегральные тест-функции. Интегральные параметры характеризуют состояние системы каждого их уровней наиболее обобщенно, давая суммарный ответ о состоянии системы. Для организма к интегральным можно отнести характеристики выживаемости, роста, плодовитости, а физиологические, биохимические, гистологические и прочие параметры относятся к более частным. Для популяций и культур интегральными оказываются характеристики её численности, массы, а выживаемость и плодовитость гидробионтов на этом уровне оказываются параметрами более частными. Чем более высокому уровню биологической интегральности соответствует исследуемая тест-функция, тем выше её экологическая значимость, тем точнее она характеризует возможное течение процессов в реальной экосистеме. Поэтому для прогноза биологических и экологических последствий токсического загрязнения целесообразно выбирать наиболее важные и интегральные функции и структурные элементы, нарушение которых влечет за собой изменении в популяциях и сообществах.. Более частные характеристики, хотя редко обеспечивают надежный прогноз развития интоксикации, но их исследование является необходимым для раскрытия механизмов и закономерностей действия токсического агента.

Химико-аналитические методы включают получение образцов для исследования, их обработку, подготовку для химического анализа. Использование таких методов направлено на исследование перемещения загрязняющего вещества в экосистемах, поступления в организмы и клетки, распределения между органами и отдельными биохимическими фракциями тканей, превращения вещества в водной среде и в тканях организма. Успехи аналитической химии в последние десяти­летия привели к разработке чувствительных приемов выявления и количественного определения потенциальных загрязняющих веществ из всех химических групп в воде и в различных субстратах. Химико-аналитические методы исследования находят применение в экспериментальной практике, а также в химическом мониторинге загрязнения водной среды. Эта методическая область настолько обширна, что существует как самостоятельное научно-практическое направление. В токсикологии играет хотя и важную, но вспомогательную роль. Токсикология использует, но не разрабатывает методы химического анализа.

Метод биоиндикации позволяет оценить действие токсиканта на экосистему в целом. Считается, что использование метода биоиндикации позволяет решать задачи экологического мониторинга в тех случаях, когда совокупность факторов антропогенного давления на биоценозы трудно или неудобно измерять непосредственно.

Биоиндикация — оценка качества природной среды по состоянию её биоты. Биоиндикация основана на наблюдении за составом и численностью видов-индикаторов.

Т.о. биоиндикацию можно определить как совокупность методов и критериев, предназначенных для поиска информативных компонентов экосистем, которые могли бы:

• адекватно отражать уровень воздействия среды, включая комплексный характер загрязнения с учетом явлений синергизма действующих факторов;

• диагностировать ранние нарушения в наиболее чувствительных компонентах биотических сообществ и оценивать их значимость для всей экосистемы в ближайшем и отдаленном будущем.

В соответствии с природоохранительным законодательством Российской Федерации, оценка качества окружающей природной среды производится с целью установления предельно допустимых норм воздействия, гарантирующих экологическую безопасность населения, сохранение генофонда и обеспечивающих рациональное использование и воспроизводство природных ресурсов в условиях устойчивого развития хозяйственной деятельности

Биоиндикатор: группа особей одного вида или сообщество, по наличию, состоянию и поведению которых судят об изменениях в среде, в том числе о присутствии и концентрации загрязнителей… Сообщество индикаторное – сообщество, по скорости развития, структуре и благополучию отдельных популяций микроорганизмов, грибов, растений и животных которого можно судить об общем состоянии среды, включая, ее естественные и искусственные изменения”.

В зависимости от целей и задач токсикологического биотестирования в качестве тест - объектов применяются различные организмы: высшие и низшие растения, бактерии, водоросли, водные и наземные беспозвоночные и другие.

Хорошим биоиндикатором является водоросль Ностак сливовидный. Наличие этого вида говорит о чистой воде. Первый признак тревоги - измельчение и нарушение правильной округлой формы изумрудных "шаров" этой водоросли.

Бурное развитие других сине-зеленых водорослей, например, осциллятории - хороший индикатор опасного загрязнения воды органическими соединениями.

Лучший индикатор опасных загрязнений - прибрежное обрастание, располагающиеся на поверхностных предметах у кромки воды. В чистых водоемах эти обрастания ярко-зеленого цвета или имеют буроватый оттенок. Для загрязненных водоемов характерны белые хлопьевидные образования. При избытке в воде органических веществ и повышения общей минерализации обрастания приобретают сине-зеленый цвет, так как состоят в основном из сине-зеленых водорослей. При плохой с избытками сернистых соединений могут сопровождаться хлопьевидными налетами нитчатых серобактерий - теотриксов.

Хорошие результаты дает анализ бентосных (придонных) беспозвоночных. Оценка чистоты водоемов делается по преобладанию, либо отсутствию тех или иных таксонов.

Трубочник образует огромные скопления в илу сильно загрязненных рек, в незначительных количествах встречаются также на песчаных и каменистых грунтах более чистых рек.

Мотыль образует большие скопления в илу сильно загрязненных органическим веществом рек.

Крыска (эриталис) - это личинка мухи - пчеловидки из семейства журчалок. Крыска обитает в загрязненных органическим веществом водоемах с черным илом и сильным запахом сероводорода.

Фитопланктон

Животные и растения, обитающие в водоемах, в результате обмена веществ оказывают сильное влияние на состояние водоема и свойств воды.

Фитопланктон наиболее распространенная и хорошо изученная из всех экологических групп водорослей. Состав фитопланктона имеет большую видовую насыщенность. Анализ видового состава, обилия и количественного развития видов фитопланктона входят во все программы экологического мониторинга водоемов.

Изучение фитопланктона водоемов производится путем сбора проб на установленных станциях.

Например, при сбросе в водоем токсических веществ, содержащихся в промышленных сточных водах, происходит угнетение и обеднение фитопланктона. При обогащении водоемов биогенными веществами, содержащимися, например, в бытовых стоках, значительно повышается продуктивность фитопланктона. При перегрузке водоемов биогенами возникает бурное развитие планктонных водорослей, окрашивающих воду в зеленый, сине-зеленый, золотистый, бурый или красный цвета ("цветение "воды). "Цветение" воды наступает при наличии благоприятных внешних условий для развития одного, редко двух-трех видов. При разложении избыточной биомассы, выделяется сероводород или другие токсичные вещества. Это может приводить к гибели зооценозов водоема и делает воду непригодной для питья. Многие планктонные водоросли в процессе жизнедеятельности нередко выделяют токсичные вещества. Увеличение в водоемах содержания биогенных веществ в результате хозяйственной деятельности человека, сопровождаемые чрезмерным развитием фитопланктона, называют антропогенным эвтрофированием водоемов.

Для количественной оценки фитопланктон и зоопланктона его концентрируют, а потом определяют численность и биомассу. Численность – в счетных камерах, биомассу вычисляют путем умножения численности на индивидуальную массу организма (вспоминаем практику у семерного).

Подчеркивая всю важность биоиндикационных методов исследования, необходимо отметить, что биоиндикация предусматривает выявление уже состоявшегося или происходящего загрязнения окружающей среды по функциональным характеристикам особей и экологическим характеристикам сообществ организмов. Постепенные же изменения видового состава формируются в результате длительного отравления водоема, и явными они становятся в случае в случае далеко идущих изменений. Таким образом, видовой, видовой состав гидробионтов из загрязняемого водоема служит итоговой характеристикой токсикологических свойств водной среды за некоторый промежуток времени и не дает ее оценки на момент исследования.

Биотестирование - использование в контролируемых условиях биологических объектов (тест-объектов) для выявления и оценки действия факторов (в том числе и токсических) окружающей среды на организм, его отдельную функцию или систему организмов.

Наиболее полно методы биотестирования разработаны для гидробионтов и позволяет использовать их для оценки токсичности загрязнений природных вод, контроля токсичности сточных вод, экспресс - анализа в санитарно-гигиенических целях, для проведения химических анализов в лабораторных целях и решения целого ряда других задач.

В зависимости от целей и задач токсикологического биотестирования в качестве тест - объектов применяются различные организмы: высшие и низшие растения, бактерии, водоросли, водные и наземные беспозвоночные и другие.

Метод биотестирования можно разобрать на примере ихтиотоксикологических исследований в водной токсикологии или ступенчатого метода тестирования в гентоксикологии:

В основу стандартной схемы ихтиотоксикологических исследований положены острый, подострый и хронический опыты.

Острый опыт.

Проводится для предварительной оценки степени токсичности и остротоксичной (явно недопустимой) концентрации вещества.

Острая оценка токсичности производится методом рыбной пробы. Показатель токсичности – гибель подопытных рыб. Подробно описываются поведение и внешние симптомы отравления.

Тест-объект – наименее устойчивый вид рыб их всей ихтиофауны конкретного водоема или один из видов рыб, характеризующихся низкой устойчивостью к токсикантам. При этом надо выбирать наименее устойчивые стадии онтогенеза.

Продолжительность острого опыта 24, 48 или 96 часов. Степень токсичности вещества целесообразно выражать через LD50. Шкала концентрации может быть равномерной (5,10,15,20 мг/л)или неравномерной (3,7,11,17,21мг/л). Испытание каждой концентрации проводят на одинаковом количестве рыб (не менее 12) в диапазоне от СМТ доCL100.

Подострый опыт.

Исп. для выявления путей действия токсиканта и механизмов развития отравления, чтобы выбрать адекватный метод определения пороговой концентрации вещества в хроническом опыте. Используются концентрации вещества, обладающие выраженным токсическим действием (обычно 0,5-0,1 остротоксической концентрации). Опыт проводится на наименее устойчивом виде рыб. Длительность 10-30 суток. Проводится параллельное изучение различных физиологических и биохимических систем организма. Наряду с показателями, интегрально отражающими состояние организма (прирост живой массы, уровень пищевой возбудимости, интенсивность потребления кислорода) используют более тонкие (показатели Б,Ж,У обмена, активность важнейших ферментативных систем, электрофизиологические тесты (на состояние ЦНС, ССС, ДС) гематологические показатели, гуморальные и клеточные факторы иммунитета, поведение).

Хронический опыт.

Задача – выявить пороговую концентрацию вещества, зону его токсического действия и максимально недействующую концентрацию вещества, то есть ПДК. Целесообразно испытывать 3-5 концентраций с пятикратными интервалами. Исходную концентрацию и диапазон концентраций выбирают, руководствуясь результатами острого и подострого опытов. Продолжительность 1-3 месяца. На основе подострого опыта выбирают показатели, характеризующие состояние избирательно поражаемых систем и органов.

Для сокращения продолжительности опытов используют метод функциональных нагрузок и на этом фоне определяют состояние индикаторной функции. Метод позволяет не только выявить нарушения в деятельности функциональной системы, но и возможность адаптации к стрессирущему воздействию.

Метод заключается в следующем: после воздействия определенного токсического вещества на организм резко меняют условия его существования. Ухудшение условий существования рыб выступает в качестве дополнительной функциональной нагрузки для оценки общего состояния организма. В результате, скрытые патологические сдвиги в организме, вызванные хроническим воздействием малых доз токсиканта, проявляются в виде дополнительных функциональных нагрузок. В качестве функциональных нагрузок могут быть использованы экспериментально вызванные инфекции и инвазии, повышенные функциональные нагрузки, вызванные длительным вынужденным плаванием, голодание, пребывание в воде с повышенной температурой или пониженным содержанием кислорода.

Ступенчатый метод исследования в генетической токсикологии

Предложен Бриджесом. Каждый фактор среды нужно проверить последовательно, на различных объектах с помощью различных методов. 1 ступень – используются самые дешевые, краткосрочные методы (скрининг исслелование). Часть факторов отсеивается. 2 ступень – более сложные и дорогие методы, отсеивается еще часть факторов, показавших мутагенную активность на первой ступени.3 ступень – наиболее дорогие и трудоемкие методы.