31.Получение трансгенных организмов.

Трансгеноз – перенос генетического материала (НК) от одной клетки к другой или от одного организма к другому. Перенос генов идет в природе: у эукариот – при половом процессе, соматическом кроссинговере, трансдукции; у прокариот – при конъюгации, трансформации, трансдукции.

Но природа ограничивает обмен: трансгеноз, как правило, идет внутри вида (кроме трансдукции).

ГИ дала возможность преодолеть запрет природы и осуществить трансгеноз между организмами не только одного вида, но и даже между империями (прокариоты ↔ эукариоты: человек ↔ бактерии) и царствами (растения ↔ животные: томаты ↔ рыбы).

Полученные с помощью ГИ организмы называют трансгенными или генетически модифицированными (ГМО).

Схема получения ГМО:

1) Получение чистого гена, который хотят внедрить в клетку-реципиент.

Методы получения генов:

а) Химический синтез.

Пригоден для получения генов, для которых известна последовательность нуклеотидов. Нуклеотиды соединяют в нужной последовательности с помощью фермента полинуклеотидлигазы. Первый ген получен группой Корана (США, 1960) в результате напряженной работы в течение четырех лет. Сейчас ведется машинный синтез: в аппараты (например, «Протва») помещают последовательно нуклеотиды, ферменты, АТФ. Рутинная, хорошо отработанная методика.

б) Ферментативный синтез (энзиматический синтез).

Стал возможен после открытия фермента «обратная транскриптаза», или «ревертаза», у РНК-содержащих вирусов.

Последовательность работы:

1. Из организма (клетки) выделяют и-РНК, считанную с нужного гена (современные методы позволяют разделять молекулы РНК). Это значительно проще, чем выделять ген (т.е. ДНК).

2. С помощью ревертазы строят на и-РНК комплиментарную цепь ДНК.

3. РНК-матрицы разрушают с помощью ферментов.

4. По полученной цепи ДНК достраивают вторую цепь ДНК. Получившаяся двухцепочечная ДНК комплементарна исходной и-РНК и называется кДНК. Таким образом, можно получить кДНК только с экзонами, без интронов. Это очень важно при переносе эукариотического гена в прокариотическую клетку, которая «не отличает» интроны и поэтому построит белок полностью согласно всем триплетам в «незрелой» и-РНК.

Пример синтеза: ГИ синтез интерферона (Дебабов, Овчинников).

в) Выделение генов из природных источников, т.е. имеющихся в природе генов.

1. Выделяют тотальную ДНК (т.е. всю ДНК клетки).

2. Режут на фрагменты рестриктазами (эндонуклеазы рестрикционного действия).

3. Плавят, т.е. разделяют на одноцепочечные нити.

4. Помещают на нитроцеллюлозный фильтр (или разгоняют электрофорезом на агарозном геле).

5. С помощью зонда находят нужный ген.

Трудности: сложно и долго найти нужный ген, проще получать его химическим синтезом, особенно если ген короткий.

2) Следующая задача – включить эти молекулы ДНК в клетки, в которых они смогут размножаться. Существуют различные векторы (переносящие агенты), основными из которых являются плазмиды. Плазмиды – короткие кольцевые молекулы ДНК, которые автономно размножаются в клетках многих бактерий. В определенных условиях плазмиды могут передаваться от бактерии к бактерии. Они содержат ряд генов, причем некоторые из них отвечают за важные для бактерий признаки. Например, в плазмидах находятсямногие гены устойчивости к антибиотикам.

3) Из бактерий выделяют плазмиды, обычно несущие ген устойчивости к определенному антибиотику.

4) Эту плазмиду разрезают рестриктазой, оставляющей однонитевые участки ДНК - «липкие концы».

5) К кДНК с помощью фермента ДНК-лигазы присоединяют адаптеры – концевые участки, содержащие сайт узнавания для той же рестриктазы, и обрабатывают эти ДНК рестриктазой.

6) Полученные ДНК «вшивают» в плазмиду с помощью ДНК-лигазы, соединяющей комплементарные «липкие концы». Эта новая молекула ДНК является рекомбинантной.

7) Плазмиды, т.е. recДНК «вставляют» в бактериальную клетку. Эффективность их включения невелика – обычно плазмидой заражается лишь одна из многих сотен тысяч бактерий.

8) Бактерий, получивших плазмиду и ген, отбирают, высевая на среду с антибиотиком. (Именно для этого и был нужен ген устойчивости: бактерии с плазмидой выживут и размножатся, а все остальные гибнут от антибиотика).

В составе плазмиды введенный ген будет удваиваться, передаваться следующим поколениям бактерий, т.е. клонироваться. Более того, при определенных условиях включенный ген будет управлять синтезом и-РНК и белков в клетке бактерий. Бактерии, которые содержат интересующий ген, можно разными способами выделить из общей массы. Наработанный ими белок можно получить в чистом виде.

Плазмиды и иные векторы позволяют также встраивать чужеродные гены в хромосомы животных и растений.

Другие пути и другие векторы для введения генов в клетку-реципиент:

а) Микроинъекция генов в пронуклеус клетки-реципиента (1980, Гордон Дж.). Гены встраиваются в хромосомы и размножаются с ними. В основном используются для трансгеноза у животных. Например, сейчас введены генов ростовых гормонов у крупного рогатого скота.

Разрабатывается:

- Замена онкогенов (разработано, но в практике еще нет)

- У человека излечиваются более десятка болезней с помощью трансгеноза

б) Электропорация – с помощью электрических импульсов, которые увеличивают проницаемость мембран, увеличивая поры.

в) Упаковка генов в липосомы (сферы из фосфолипидов). Липосомы захватываются клетками, и ДНК нужного гена поступает в клетку.

г) Бомбардировка микрочастицами: на частицы золота или вольфрама наносят recДНК, помещают в «генные пушки», после выстрелов частицы металла с генами оказываются в клетке.

д) С помощью МГЭ – мобильных генетических элементов.