37. Методы генной инженерии.

Биотехнология – это использование живых организмов (в основном м/о) и биологических процессов для нужд человека ( в том числе производстве) /урванцева/

Прикладная генетическая инженерия включает:

• Синтез несколько десятков белков (инсулин)

• Получение трансгенных растений (>80 видов растений получено)

• Получение химерных животных

• Клонирование млекопитающих

• Генная терапия (1998г)

Таблицы

• Уровни организации

• Схема ГИ-работ

• Строение ДНК

• Репликация + транскрипция

ГИ в России относят к биотехнологии. Биотехнология – комплекс наук, объединены только тем, что технологии с использованием живых организмов.

Генетическая инженерия – раздел генетики, где молекулярная генетика находит выход в практику. Это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать искусственные генетические системы, которые затем вводятся в организм, сообщая ему новые признаки. Т.е. это не учение, не обобщающая теория, а совокупность методов.

Суть ГИ: создание in vitro ДНК посредством соединения фрагментов ДНК (rec ДНК), которые в естественных условиях чаще не соединяются (межвидовые барьеры).

Схема ГИ-работ:

1. Получение чистой ДНК (т.е. гена)

2. Получение вектора = повозки, структуры, которая введет, «втащит» ген в клетку-реципиент (фаги, плазмиды, хромосомы)

3. Получение гибридной rec-ДНК, т.е. присоединение гена к вектору

4. Введение rec-ДНК в клетку-реципиент

5. Клонирование rec-ДНК и отбор клонов, несущих нужный ген

Подробнее о каждом этапе:

1. Получен ген (хим. синтез, ферментативный синтез или выделение из существующих геномов)

2. Получают «липкие концы» - рестриктазой. Получение вектора: плазмида, фаг, хромосома – режут той же рестриктазой («вскрывают вектор»)

3. Гибридизация – лигаза

4. Введение в клетку-реципиент

5. Отбор клеток по наличию вектора и гена на определенных средах («маркерные гены»)

Получение чистых генов в ГИ может осуществляться несколькими методами: химический синтез, ферментативный синтез, выделение генов из природных источников.

Методы получения генов:

а) Химический синтез.

Пригоден для получения генов, для которых известна последовательность нуклеотидов. Нуклеотиды соединяют в нужной последовательности с помощью фермента полинуклеотидлигазы. Первый ген получен группой Корана (США, 1960) в результате напряженной работы в течение четырех лет. Сейчас ведется машинный синтез: в аппараты (например, «Протва») помещают последовательно нуклеотиды, ферменты, АТФ. Рутинная, хорошо отработанная методика.

б) Ферментативный синтез (энзиматический синтез).

Стал возможен после открытия фермента «обратная транскриптаза», или «ревертаза», у РНК-содержащих вирусов.

Последовательность работы:

1. Из организма (клетки) выделяют и-РНК, считанную с нужного гена (современные методы позволяют разделять молекулы РНК). Это значительно проще, чем выделять ген (т.е. ДНК).

2. С помощью ревертазы строят на и-РНК комплиментарную цепь ДНК.

3. РНК-матрицы разрушают с помощью ферментов.

4. По полученной цепи ДНК достраивают вторую цепь ДНК. Получившаяся двухцепочечная ДНК комплементарна исходной и-РНК и называется кДНК. Таким образом, можно получить кДНК только с экзонами, без интронов. Это очень важно при переносе эукариотического гена в прокариотическую клетку, которая «не отличает» интроны и поэтому построит белок полностью согласно всем триплетам в «незрелой» и-РНК.

Пример синтеза: ГИ синтез интерферона (Дебабов, Овчинников).

в) Выделение генов из природных источников, т.е. имеющихся в природе генов.

1. Выделяют тотальную ДНК (т.е. всю ДНК клетки).

2. Режут на фрагменты рестриктазами (эндонуклеазы рестрикционного действия).

3. Плавят, т.е. разделяют на одноцепочечные нити.

4. Помещают на нитроцеллюлозный фильтр (или разгоняют электрофорезом на агарозном геле).

5. С помощью зонда находят нужный ген.

Трудности: сложно и долго найти нужный ген, проще получать его химическим синтезом, особенно если ген короткий.

После получения генов следующая задача – включить эти молекулы ДНК в клетки, в которых они смогут размножаться. Существуют различные векторы (переносящие агенты), основными из которых являются плазмиды. Плазмиды – короткие кольцевые молекулы ДНК, которые автономно размножаются в клетках многих бактерий. В определенных условиях плазмиды могут передаваться от бактерии к бактерии. Они содержат ряд генов, причем некоторые из них отвечают за важные для бактерий признаки. Например, в плазмидах находятся многие гены устойчивости к антибиотикам.

1) Из бактерий выделяют плазмиды, обычно несущие ген устойчивости к определенному антибиотику.

2) Эту плазмиду разрезают рестриктазой, оставляющей однонитевые участки ДНК - «липкие концы».

3) К кДНК с помощью фермента ДНК-лигазы присоединяют адаптеры – концевые участки, содержащие сайт узнавания для той же рестриктазы, и обрабатывают эти ДНК рестриктазой.

4) Полученные ДНК «вшивают» в плазмиду с помощью ДНК-лигазы, соединяющей комплементарные «липкие концы». Эта новая молекула ДНК является рекомбинантной.

5) Плазмиды, т.е. recДНК «вставляют» в бактериальную клетку. Эффективность их включения невелика – обычно плазмидой заражается лишь одна из многих сотен тысяч бактерий.

6) Бактерий, получивших плазмиду и ген, отбирают, высевая на среду с антибиотиком. (Именно для этого и был нужен ген устойчивости: бактерии с плазмидой выживут и размножатся, а все остальные гибнут от антибиотика).

В составе плазмиды введенный ген будет удваиваться, передаваться следующим поколениям бактерий, т.е. клонироваться. Более того, при определенных условиях включенный ген будет управлять синтезом и-РНК и белков в клетке бактерий. Бактерии, которые содержат интересующий ген, можно разными способами выделить из общей массы. Наработанный ими белок можно получить в чистом виде.

Плазмиды и иные векторы позволяют также встраивать чужеродные гены в хромосомы животных и растений.

Существуют другие пути и другие векторы для введения генов в клетку-реципиент:

а) Микроинъекция генов в пронуклеус клетки-реципиента (1980, Гордон Дж.). Гены встраиваются в хромосомы и размножаются с ними. В основном используются для трансгеноза у животных. Например, сейчас введены гены ростовых гормонов у крупного рогатого скота.

Разрабатывается:

- Замена онкогенов (разработано, но в практике еще нет)

- У человека излечиваются более десятка болезней с помощью трансгеноза

б) Электропорация – с помощью электрических импульсов, которые увеличивают проницаемость мембран, увеличивая поры.

в) Упаковка генов в липосомы (сферы из фосфолипидов). Липосомы захватываются клетками, и ДНК нужного гена поступает в клетку.

г) Бомбардировка микрочастицами: на частицы золота или вольфрама наносят recДНК, помещают в «генные пушки», после выстрелов частицы металла с генами оказываются в клетке.

д) С помощью МГЭ – мобильных генетических элементов.

Метод трансгеноза – для получения трансгенных животных чаще используется метод микроинъекций в пронуклеусы. При трансгенозе растительных генов используются плазмиды, которые существуют в Аgrobactirium, «Ti» и «Ri» плазмиды.

Метод ПЦР – полимеразная цепная реакция. ПЦР – очень широко применяется в настоящее время. Позволяет за несколько часов размножить в пробирке единственную исходную молекулу ДНК в млрд копий. Таким образом, можно брать мало материала: 1 клетку из эмбриона in vitro, т.е. до имплантации. Таким образом, можно манипулировать с эмбрионами и стволовыми клетками. Понятно, что такие возможности могут представлять опасность и должны контролироваться государством и общественностью. В настоящее время метод ПЦР широко применяется для диагностики:

- инфекционных заболеваний,

- наследственных заболеваний и предрасположенности к ним

- установления личности (Чечня, Хусейн)

- в судебно-медицинской экспертизе

- установление родства

- получение генов

Молекулярная гибридизация - позволяет установить родство организмов. Используется в специальной науке – геносистематике для установления происхождения и эволюции организмов.

Схема работ по МГ:

1. Из клетки выделяют всю ДНК (тотальная ДНК) или РНК транскрибированного с нужного нам гена (современные методы позволяют разделить РНК).

2. С помощью ферментов рестриктаз или методом «дробовика» ДНК режут на куски.

3. Плавление (двухцепочечную ДНК разделяют на одиночные цепи в щелочной среде при температуре 95º).

4. Полученные фрагменты ДНК помещают на нитроцеллюлозный фильтр или разгоняют электрофорезом в агарозном геле.

5. С помощью радиоактивного или химического зонда находят нужный ген.