3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

1.2.11. Методика вкусового отвращения

Питье крысами приятных на вкус растворов (например, сахарина) подавляется, когда их потребление предварительно сочетается с веществами с резким, неприятным вкусом, например, лития хлоридом. Условное вкусовое отвращение к сахарину устраняется транквилизаторами [12].

1.2.12. Методика акустической стартл-реакции

Методика акустической стартл-реакции (стартл, вызванный страхом) основана на страхе животного, возникающем при действии внезапного резкого звукового раздражителя [18, 27]. Реакция страха у животного выражается в стартл-реакции, характеризующейся вздрагиванием и замиранием животного. Реакция замирания регистрируется по времени полного отсутствия движения животного, включая движение вибрисс. Продолжительность этой реакции определяет уровень анксиогенного состояния, которое редуцируется под влиянием транквилизатора. Часто в исследовании используют условный световой или звуковой сигналы, сопряженные с электрическим током — безусловным раздражителем, и в этих условиях действие одного условного сигнала вызывает стартл-реакцию.

1.2.13. Стресс у крысят

Стресс у крысят возраста 16–20 дней возникает при отнятии их от матери или из гнезда или при воздействии холодом и выражается в характерных звуках (ultrasonic 35– 55 kHz), издаваемых крысятами. Транквилизаторы бензодиазепинового ряда и буспирон обладают способностью устранять стрессорную вокализацию крысят, что свидетельствует об их анксиолитическом эффекте [11].

1.2.14. Методика вызванной стрессом гипертермии у мышей

Мышей помещают в индивидуальные клетки, им вводится препарат и через час при помощи электротермометра с ректальным датчиком (погружение электрода на глубину 1,5–1,8 см) регистрируется ректальная температура (Т1 — базовый показатель) и еще через 15 мин (через 75 мин после введения вещества) делается повторное измерение температуры (Т2) Различие между Т1 и Т2 рассматривается как стресс-вызванная гипертермия (SIH) [34]. У контрольных мышей показатель SIH (Т1–Т2) колеблется от +0,7 до +1,0, а после введения бензодиазепина — от -0,1 до +0,1.

1.2.15. Методика паники у крыс, вызванная лактатом

Хроническое ингибирование синтеза ГАМК в дорзомедиальном гипоталамусе крыс посредством локального введения с помощью минипомпы ингибитора ГАМК L-аллилглицина и последующей инфузией лактата натрия вызывает у животных состояние хронического беспокойства и панические реакции, уменьшает время взаимодействия животных в тесте социального обследования.

Кроме того, для изучения действия веществ с анксиолитическим действием используется целый ряд других, реже встречаемых тестов: методика консуматорного поведения (усиленного потребления пищи), стимуляция околоводопроводного серого вещества, методика лекарственной дифференцировки и лекарственной дискриминации анксиолитических и анксиогенных веществ, различные виды стресса, вызванного холодом, гипертермией, и агрессивного/оборонительного поведения и др.

2. Сопутствующие анксиолитическому эффекту психотропные эффекты, побочное действие и острая токсичность

В дополнение к данным об основном анксиолитическом эффекте должны быть представлены результаты исследования других проявлений действия нового препарата и сведения об его острой токсичности. Ориентируясь на данных о спектре фармакологической

271

активности известных транквилизаторов, следует представить исследования о наличии или отсутствии у изучаемого вещества седативного или активирующего, противосудорожного, снотворного, антидепрессивного и миорелаксантного действия, исследовать его влияние на обучение и память.

Для выявления этих эффектов можно использовать общепринятые тесты. Для оценки седативного или активирующего действия можно применить регистрацию поведения в открытом поле и в различных актометрах, тест залезания на сетку; для предварительной оценки снотворного эффекта — тест потенцирования гексеналового сна или других снотворных; оценка противосудорожного действия осуществляется по антагонизму с судорожными веществами (коразол, тиосемикарбазид, бикукуллин и др.) и при судорогах, вызванных максимальным электрошоком; изучение влияния вещества на условнорефлекторную деятельность и процессы обучения и памяти осуществляется с использованием рефлексов активного и пассивного избегания, лабиринтных рефлексов, оперантного поведения (используется 2 теста); для исследования антидепрессивной активности можно использовать метод поведенческой беспомощности; для изучения миорелаксантного действия используются тесты вращающегося стержня, рефлекса подтягивания на перекладине, удерживания на перевернутой сетчатой платформе, тест бокового положения. Исследование дополнительных психотропных эффектов проводится в диапазоне терапевтических, оказывающих анксиолитический эффект доз.

Изучение побочных эффектов (седативный, миорелаксантный, негативное влияние на память и др.) следует осуществлять в широком диапазоне доз от минимальных терапевтических до субтоксических. Нужно использовать не менее двух видов животных и путь введения, соответствующий предполагаемому клиническому. Информация о побочных эффектах дополняется результатами, полученными в разделе «Изучение общей фармакологической активности».

Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых осуществлялось исследование анксиолитической активности, при тех же путях введения; рассчитывается ЛД50. По соотношению доз, вызывающих специфический (анксиолитический) эффект, и доз, оказывающих побочный и токсический эффект, определяется широта терапевтического действия. Данные по побочным эффектам и токсичности нового препарата сопоставляются с данными, полученными для эталонных препаратов.

3. Изучение толерантности и возможной лекарственной зависимости при длительном применении анксиолитического препарата и его отмене

Изучается переносимость препарата и развитие толерантности по анксиолитическому и побочным проявлениям действия при длительном (не менее 28 дней) введении препарата.

В связи с риском возникновения лекарственной зависимости к новому анксиолитику обязательными являются исследования по изучению развития абстинентного синдрома при отмене препарата после его длительного применения. Методология и описание этих исследований приведены в работе [4]. Кроме того, желательно провести исследования с использованием модели самовведения препарата или других методик для выявления возможного наркогенного потенциала.

4. Исследование механизма действия анксиолитического препарата

Реализация действия анксиолитиков, как известно, может осуществляться через взаимодействие с различными мишенями, например, через системы тормозных и возбуждающих аминокислот, моноаминов, гормонов, нейропептидов, нейротрофинов и др. В связи с этим следует представить данные по изучению механизма действия изучаемого анксиолитика в зависимости от направленности его нейрохимических эффектов. Рекомендуется определить нейрорецепторный профиль изучаемого вещества, в том числе используя методы радиолигандного связывания, а таже другие биохимические

272

методы, в том числе изучение сдвигов нейромедиаторного баланса, вторичных мессенджеров и т.д.

Желательно проведение электрофизиологического анализа механизма действия вещества с анксиолитическим эффектом, в частности, оценку спектра мощности в различных структурах мозга.

5. Изучение общей фармакологической активности анксиолитического препарата, влияния

на сердечно-сосудистую систему и дыхание

Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и крысах при введении препарата в широком диапазоне доз от не оказывающих заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель. При этом определяется повышение или снижение возбудимости, увеличение или снижение двигательной активности, наличие тремора, судорожных подергиваний, судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов, взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг и т.д. Изучается пиннеальный, болевой и роговичный рефлексы, влияние на температуру тела, на потребление воды и пищи. Следует изучить влияние препарата на эффекты нейромедиаторов. Например, на эффекты ареколина, треморина, 5-окситриптофана, фенамина, резерпина, дофамина, апоморфина, бикукуллина, флумазенила, дизоцилпина и других анализаторов нейромедиаторных систем.

Влияние на ССС, дыхание и на периферические отделы нервной системы изучается на интактных или наркотизированных кошках, кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного давления, ритм сердечной деятельности (желательно и других показателей работы сердца), дыхание, а также на реакции, вызванные введением нейромедиаторов, например, адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серотонина.

Заключение

Результаты экспериментального изучения нового препарата с анксиолитическим (транквилизирующим) действием должны содержать материалы, доказывающие наличие у него специфической анксиолитической активности и отличия и преимущества нового препарата перед уже известными анксиолитиками. Например, новое вещество по сравнению с уже существующими должно обладать большей избирательностью специфического анксиолитического эффекта или иметь меньшие побочные эффекты

итоксичность и большую терапевтическую широту, или новое вещество должно обладать уникальным сочетанием свойств и новым механизмом действия, или новое средство предлагается для лечения таких состояний, при которых существующие препараты малоэффективны и др.

Исследования следует проводить на различных видах лабораторных животных, например, мыши и крысы, а при необходимости можно использовать и более крупных животных (кошки, собаки, кролики). Полученные данные обрабатываются статистически с помощью современных методов статистики и представляются в виде таблиц, а при необходимости и рисунков.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные

итестируемые вещества.

Литература

1.Воронина Т.А., Фармакология феназепама. — В кн.: Феназепам / под ред. А.В. Богатского. — Киев: Наукова Думка, 1982. — С. 87–169.

273

2.Воронина Т.А., Спектр фармакологической активности гидазепама и его место среди известных транквилизаторов. — В кн.: «Гидазепам» (Андронати С.А., Воронина Т.А., Головенко Н.Я. — ред.). — Киев: Наукова Думка, 1992. — С. 63–75.

3.Воронина Т.А., Неробкова Л.Н., Маркина Н.В. и др. Возможные механизмы действия мембраноактивных веществ с антиоксидантными свойствами в экстремальных ситуациях., Сб. «Клеточные механизмы реализации фармакологического эффекта» (Середенин С.Б. — ред.). — М.: Институт Фармакологии АМН СССР, 1990. — С. 54–77.

4.Гарибова Т.Л., Калинина Т.С., Воронин К.Э. Проблема толерантности и лекарственной зависимости к гидазепаму. — В кн.: Гидазепам (Андронати С.А., Воронина Т.А., Головенко Н.Я. — ред.), Киев: Наукова Думка, 1992. — С. 83–91.

5.Гарибова Т.Л., Воронина Т.А., Стефанков Д.В., Калинина Т.С. Оценка действия фармакологических средств на основе новой компьютерной программы для анализа оперантного поведения животных // Фармакол. и токсикол., 1990. — Т. 53. — № 1. — С.67–70.

6.Иноземцев А.Н., Бокиева С.Б., Воронина Т.А.,Тушмалова Н.А. Обратимое функциональное нарушение реакции избегания как модель для изучения влияния транквилизаторов. — Экспер. и клин. фармакол., 1996а. — Т. 59. — № 2. — С. 3—5.

7.Иноземцев А.Н., Воронина Т.А., Прагина Л.Л. и др. Различие в эффектах пирацетама и феназепама при эмоциональном напряжении, вызываемом пространственной переделкой навыка. — Экспер. и клин. фармакол., 1996б — Т. 59. — № 6. — С. 101–103.

8.Молодавкин Г.М., Воронина Т.А. Многоканальная установка для поиска транквилизаторов и изучения механизма их действия по методу конфликтная ситуация. — Экспер. и клин. фармакол., 1995. — Т. 58. — № 2. — С. 54–56.

9.Середенин С.Б., Ведерников А.А. Влияние психотропных препаратов на поведение линейных мышей в условиях эмоционального стресса. — Бюлл. экспер. биол. и мед., 1979. — Т. 88. — № 7. — С. 38–40.

10.Середенин С.Б., Бледнов Ю.А., Наговицина Ю.А. Анализ ионной регуляции специфического связывания диазепама в зависимости от фенотипа эмоциональной стрессовой реакции. — Бюлл. экспер. биол. и мед.,1992. — Т. 114. — № 11. — С. 459–461.

11.Середенин С.Б., Виглинская И.В., Колик Л.Г. Исследование анксиолитического действия нового производного 2-меркаптобензамидазола у MR и MNRA крыс. — Экспер. и клин. фармакол., 1997. — Т. 60. — № 3. — С. 3–6.

12.Barrett J.E., Animal behavior models in the analysis and understanding of anxiolytic drugs acting at serotonin receptors., In: Animal Models in Psychopharmacology., Adv. Pharmacol. Sci., (Oliver B., Mos J., Slangen J.L., eds), Birkhauser Verlag Basel, 1991. — p. 37–52.

13.Belzung C., Griebel G., Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav. Brain Res, 2001. — V. 125. — p. 141–149.

14.Boissier J.R., Simon P., Aron C., A new method for rapid screening of minor tranquilizers in mice., Europ. J. Pharmacol., 1968. — V. 4, p. 45–51.

15.Corbett R., Fielding S., Cornfeldt M., Dunn R., GABA-mimetic agents display anxiolytic-like e ects in the social interaction and elevated plus maze procedures., Psychopharmacology,1991. — V. 104, p. 312–316.

16.Costal B., Jones B.J., Kelly M.E., et al., Exploration of mice in a black and white test box: validation as a model of anxiety., Pharmacol. Biochem. Behav., 1989, v. 32, p. 777–785.

17.Czech D.A., Quock R.M., Nitrous oxide induced an anxiolytic-like e ect in the conditioned defensive burying paradigm, which can be reversed with abenzodiazepine receptor blocker., Psychopharmacology, 1993, v. 113, № 2, p. 211–216.

18.Davis M., Redmond D.E., Baraban J.M., Noradrenergic agonists and antagonists: e ects on conditioned fear as measured by the potentiated startle paradigm., Psychopharmacology, 1979, v. 9, p. 307–320.

19.Dawson G.R., Tricklebank M.D., Use of the elevated plus-maze in the search for novel anxiolytic agents., Trends in Pharmacol. Sci., 1995, v. 16, № 2, p.33–36.

20.Dooley D.J., Klamt I., Di erential profile of the CCK-b receptor antagonist CI-988 and diazepam in the four-plate test., Psychopharmacology, 1993, v. 112, № 4, p. 452–454.

21.File S.E., The social interaction test of anxiety., Neurosci. Protocols, 1993, v.1, p. 1–7.

22.File S.E., Animal models of di erent anxiety states., In: GABAa receptors and anxiety: from neurobiology to treatment., №.Y. Raven Press, 1995, p. 93–113.

23.File S.T., Zangrossi H., Sanders F.L., Mabbutt P.S., Raised corticosterone in the rat after exposure to the elevated plus-maze., Psychopharmacology, 1993, v. 113, p. 543–546.

274

ГЛАВА 17

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С НООТРОПНЫМ ТИПОМ ДЕЙСТВИЯ

Составители: д. м. н., проф. Т.А. Воронина; д. м. н., проф. Р.У. Островская; д. м. н., проф. Т.Л. Гарибова

Введение

Ноотропные препараты (НП) составляют особую группу нейропсихотропных препаратов, специфический эффект которых определяется способностью улучшать процессы обучения и памяти, когнитивные, интеллектуальные функции как у здоровых лиц, так и в особенности нарушенные при различных заболеваниях. В зарубежной литературе как синоним НП иногда используется термин «усилитель когнитивных функций» cognition enhancers [3, 42]. Спектр показаний для применения НП очень широк. Согласно международой классификации МКБ-10, НП применяют при болезнях класса V «Психические расстройства и расстройства поведения». Они используются при старении организма; психоорганических синдромах нейродегенеративного или сосудистого генеза (сенильная деменция, в том числе болезнь Альцгеймера); при острых

ихронических нарушениях мозгового кровообращения, в том числе при инсультах и энцефалопатиях; после черепно-мозговых травм, нейроинфекций; при остром и хроническом утомлении, синдроме хронической усталости, при стрессе, болевых синдромах; при заболеваниях, вызванных длительным приемом алкоголя и наркотиков, терапией анксиолитиками, антипсихотическими средствами и другими депрессантами ЦНС; при астеническом, астено-депрессивном и депрессивном синдромах, невротических расстройствах, вегето-сосудистой дистонии, головокружении; для профилактики укачивания. В педиатрии НП используют при цереброастенических, энцефалопатических нарушениях, расстройствах памяти, при задержке психического и речевого развития, умственной отсталости, при последствиях перинатального поражения ЦНС, синдроме дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ). НП используется здоровыми людьми, когда в силу определенных ситуаций необходимо повысить умственную работоспособность, концентрацию внимания, улучшить продуктивность работы, способность к планированию и принятию решений, увеличить скорость извлечения памятного следа

иобъем памяти и т.д.

КНП относятся вещества с различным химическим строением и механизмом действия.

1.Классификация веществ с ноотропным

инейропротекторным действием

1.1.Активаторы метаболизма мозга

ибелково-нуклеинового синтеза

1.1.1.Пирролидоновые ноотропные препараты: пирацетам, фенотропил, оксирацетам, анирацетам, прамирацетам, этирацетам, дипрацетам, ролзирацетам, небрацетам, изаце-

276

там, нефирацетам, детирацетам, алорацетам, тенилсетам, фасорацетам, леветирацетам, унифирам, сунифирам и др.

1.1.2. Вещества природного происхождения и близкие к ним: церебролизин, аналоги церебролизина N-PEP-12 и E021, актовегин, церебрал, липоцеребрин, цереброкурин, кортексин, пиритинол, пиявит, пантогематоген, полидан и др.

1.2. Ноотропные препараты, реализующие действие через нейромедиаторные системы

1.2.1.Холинергические вещества

1.2.1.1.Вещества, вызывающие усиление синтеза ацетилхолина и его выброса: холин хлорид, фосфотидилсерин, лецитин, ацетил-L-карнитин, МКС-231, клобенпропит, тиоперамин GT-2016, иодопроксифан, UCL-1390, AQ-0145, ZK9346-бетакарболин, линопирдин (DUP 996) и др.

1.2.1.2.Ингибиторы ацетилхолинэстеразы: донепезил, ривастигмин, галантамин, физостигмин, такрин, амиридин, нейромедин, метрифонат, велнакрин малеат, эртастигмин, зифросинол, минаприн, капроктамин, гаперзин А, фенсерин и др.

1.2.1.3.Агонисты м-холинорецепторов: ксаномелин, миламелин, сабкомелин, AF102В, цевимелин, алвамелин, УМ-796, AF151, талсаклидин (WAL2014FU), SCH-57790, SCH72788, оксотреморин, бетанехол и др.

1.2.1.4.Агонисты н-холинорецепторов: АВТ098, АВТ089, АВТ418, эпибатид, анабазин, ТС1734, МЕМ3453, SIB-1553A, SSR180711, GTS21 и др.

1.2.2. Вещества, влияющие на систему возбуждающих аминокислот: глутаминовая кислота, мемантин, милацемид, глицин, D-циклосерин, нооглютил, ампалекс, анирацетам, унифирам, сунифирам, 4-аминопиперидины, димебон, СР101606, NPS1506 и др.

1.2.3. Вещества, влияющие на систему ГАМК: гаммалон, натрия, лития и кальция оксибутират (нейробутал), пикамилон, фенибут, пантогам, никотинамид, габапентин, PCALC36, SB737552, NS105 и др.

1.2.4. Вещества, влияющие на серотонинергическую систему: антагонист 5HT6 рецепторов SB742457, частичный агонист 5HT4 рецепторов SL650155, агонисты 5-HT1A рецепторов — халипроден, 8-OH-DPAT и др., антагонисты 5-HT3 рецепторов — ондансетрон и мирисетрон.

1.2.5. Вещества, влияющие на дофаминергическую систему и ингибиторы МАО: пирибедил, сумаринол, ВР897 и АВТ431, NS2330, лазабемид, селегилин, расагилин и др.

1.2.6. Вещества, влияющие на аденозиновую систему, фосфодиэстеразу: кофеин, пропентофиллин, ролипрам, МЕМ1414, НТ0712 и др.

1.2.7. Вещества, влияющие на гистаминовую систему: А349821 и др.

1.2.8. Нейропептиды и их аналоги: АКТГ 1-10 и его фрагменты, эбиратид, семакс, ноопепт, соматостатин, вазопрессин, тиролиберин и их аналоги (NC1900, FK960 и др.), нейропептид Y, субстанция Р, ангиотензин-II, холицистокинин-8, ингибиторы пролилэндопептидазы (JTP-4819, S17092, ЗП-20, ЗП-22 и др.), беглимин и др.

1.3. Нейростероиды и мелатонин: 7-β-эстрадиол, эстадерм, J811, J861 дегидроэпиандростерон (DHEA) и его сульфат (DHEAS), карбеноксолон, мелатонин.

1.4. Антиоксиданты: мексидол, дибунол, фосфотидилсерин, пиритинол, эксифон, цитидиндифосфохолин, тирилазад месилат, меклофеноксат, атеровит, альфа-токоферол, эбселен, эмоксипин, гингко билоба и др.

1.5. Антагонисты кальция: нимодипин, нивалдипин, циннаризин, флунаризин и др. 1.6. Церебральные вазодилататоры: винкамин, винпоцетин, ницерголин, гидер-

гин, винконат, виндебумол, нафтидрофурил и др.

1.7. Вещества, влияющие на протеинкиназы: этимизол, СЕР 1347, AS601245 и др.

1.8. Витамины и их аналоги, пищевые добавки, вещества растительного происхождения: витамины Е, В6, В12, фолиаты, тиамин, лецитин (фосфотидилхолин), фос-

277

фотидилсерин, альфа-липоевая кислота, L-карнитин, ацетил-L-карнитин, гингко билоба, женьшень, лимонник и др.

1.9.Вещества, влияющие на нейротрофиновую систему: прямые (фрагменты NGF92-97 в β поворотной конформации, сурамин) и непрямые (аналоги аденозина) активаторы Trk рецепторов; вещества, влияющие на экспрессию и секрецию нейротрофинов (неотрофин, семакс, идебенон, агонисты и позитивные модулторы AMPA-рецепторов); модуляторы нейротрофиновой системы (церебролизин, СЕР-1347, NDD-094).

1.10.Вещества, влияющие на процесс нейродегенерации при болезни Альцгеймера:

вещества, уменьшающие синтез и влияющие на агрегацию, деагрегацию и депонирование β-амилоида и производящие «очистку» амилоидных бляшек, хелатирующие металлы, вещества, уменьшающие гиперфосфорилирование белка тау и блокаду тау-агрегации, увеличивающие уровень шаперонов, противовоспалительные средства, статины и др.

1.11.Средства для лечения синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ) у детей и взрослых: метилфенидат, амфетамины, атомоксетин, модафинил, фенибут, фенотропил и др.

1.12.Комбинированные препараты: фезам (пирацетам, циннаризин), винтотропил (пирацетам, винпоцетин), ороцетам (пирацетам, оротовая кислота), диапирам (пирацетам, диазепам), нейронал (пирацетам, янтарная кислота, рибоксин, никотинамид, рибофлафин-мононуклеотид, пиридоксин), инстенол (гексабидин, этамиван, этафиллин), цитофлавин (янтарная кислота, рибоксин, никотинамид, рибофлафинмононуклеотид) и др.

1.13.Вещества из разных групп: оротовая кислота, метилглюкооротат, фолиевая кислота, ганглиозиды, глюкокортикоиды, геровитал Н3, диметиламиноэтанол (ДМАЭ), СДР-холин (цитохолин) и др.

2. Общие положения

Исследование новых веществ с предполагаемым ноотропным действием следует проводить на различных видах животных (мыши, крысы, а при необходимости и др. виды). Полученные данные обрабатываются с помощью современных методов статистики и представляются в виде таблиц и рисунков. Далее представлены методы, использование которых является обязательным для всех препаратов.

Изучение необходимо проводить в сравнении с эталонными препаратами: пирацетамом или другим препаратом пирролидоновой группы и желательно с эталонным препаратом, близким по химическому строению и механизму действия с новым веществом. По каждому тесту следует использовать не менее 3-х доз вещества.

Должны быть использованы по меньшей мере два пути введения, один из которых должен соответствовать предполагаемому клиническому способу применения. Для последнего необходимо представить параметры начала действия и продолжительности эффекта. С целью изучения возможных явлений толерантности и лекарственной зависимости необходимо изучить эффект предлагаемого НП в условиях длительного (не менее 1 месяца) введения с последующей отменой. Методика этих исследований описана в работе [7].

3. Методы изучения специфической ноотропной активности

Изучение специфической ноотропной активности новых веществ делится на два этапа. Первый этап — скрининг с использованием простых методов исследования влияния на обучение и память, второй — расширенное изучение спектра фармакологической активности веществ.

3.1.І этап. Влияние на обучаемость

вметодике условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ)

Базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведе-

ние памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия) является методика

278

условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [2]. Основными преимуществами этой методики является быстрота выработки рефлекса (обучение с одной пробы) и возможность дифференцированно воздействовать на различные фазы памяти.

Существует несколько вариантов методики условных рефлексов пассивного избегания, вырабатываемых в одном сочетании. Наиболее часто используемая форма УРПИ — обучение животных (крыса, мышь) в установке, состоящей из двух отсеков: затемненного и освещенного, соединенных дверцей. Помещенное в освещенный отсек (хвостом к дверце) животное довольно быстро переходит через дверь в затемненный отсек (норковый рефлекс) и затем (в различных модификациях метода либо сразу после входа, либо через определенный период пребывания в темном отсеке) получает там электрокожное раздражение через электродный пол. Параметры этого болевого раздражения (сила, длительность) могут варьировать, но они должны быть достаточными, чтобы обучить животное УРПИ. Электроболевое раздражение наносится либо в течение определенного времени, для чего дверца закрывается заслонкой, либо до тех пор, пока животное не возвратится в освещенный отсек через оставшуюся открытой дверцу. В том и другом случае животное должно обучиться не заходить в темную камеру, где оно получило болевое раздражение, и пассивно избегать неприятную ситуацию, находясь в светлом отсеке.

Могут быть использованы и другие варианты установок для обучения УРПИ. Животное помещают на освещенную, находящуюся на высоте платформу; в силу свойственного грызунам норкового рефлекса оно переходит в соединенную с платформой темную камеру, где получает обучающее электроболевое раздражение через электродный пол; о степени обучения судят по латентному времени первого захода в темную камеру и длительности нахождения на платформе при повторном помещении туда животного [27]. Еще одним вариантом является методика, в которой безопасная платформа находится в середине электрифицированного пола; при переходе на этот пол животное получает болевое раздражение и, чтобы избежать его, должно оставаться на безопасной площадке. Во всех описанных выше модификациях методики УРПИ параметры электроболевого раздражения, наносимого через электродный пол, составляют 0,3–0,6 мА.

Проверка сохранения УРПИ (воспроизведение рефлекса) состоит в повторном помещении животного в освещенный отсек, висячую платформу и т.д. через различные интервалы времени (6 или 8, или 24, или 48, или 72 ч, или 7 сут и т.д.). Наиболее часто используется интервал 24 ч. Для оценки степени обучения через эти интервалы регистрируется латентное время первого захода в темный отсек камеры, где ранее с использованием болевого раздражения проводилось обучение, и время, проведенное в светлом и темном отсеках за фиксированный интервал (2 или 3 мин).

3.2. Влияние на различные фазы памяти в методике УРПИ

Для исследования влияния веществ на фазы памяти используется методика УРПИ, описанная выше. Вещество в этом случае вводится в различные стадии формирования памятного следа [35]. Для получения данных о влиянии вещества на процесс ввода и первоначальной обработки информации вещество вводится непосредственно перед процедурой обучения, а проверка обученного осуществляется через 24 ч. Для получения данных о влиянии вещества на процесс консолидации вещество вводится непосредственно после процедуры обучения, а проверка также осуществляется через 24 ч. Для получения данных о влиянии вещества на процесс извлечения информации вещество вводится перед воспроизведением рефлекса (через 24 ч после обучения). Регистрируется во всех случаях при воспроизведении УРПИ: латентное время первого захода в опасный, темный отсек и общее время нахождения в светлом и темном отсеках за определенный интервал времени. С целью оценки влияния предполагаемого НП на процессы забывания тестирование сохранения памятного следа осуществляется спустя отдаленные интервалы (2–8 недель).

279

3.3. Амнезия УРПИ, вызванная электрошоком

Амнезию условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) можно вызвать многими способами, но наиболее принятыми и широко применяемыми являются амнезии, вызванные максимальным электросудорожным шоком (припадком) или введением скополамина [2,6]. Электросудорожный шок (ЭШ) наносится через электроды, наложенные на роговицу глаз (15–20 мА, 200–500 мсек) или на поверхность ушных раковин (10– 100 мА, 200–500 мсек) мышей или крыс непосредственно после выработки условной реакции пассивного избегания. Воспроизведение рефлекса осуществляют через различные интервалы времени, наиболее часто через 24 или 48 ч. Регистрируется латентное время первого захода животного в темный опасный отсек и общее время пребывания животного в темном и светлом отсеках за определенный период времени (2 или 3 мин). ЭШ вызывает амнезию УРПИ, которая выражается в уменьшении латентного времени захода в темный опасный отсек и в увеличении времени пребывания в темном отсеке.

Для оценки антиамнестического действия веществ их следует вводить, в зависимости от цели исследования, или до обучения, что делается наиболее часто, или непосредственно перед действием ЭШ, или перед воспроизведением УРПИ. Ноотропный эффект во всех случаях выражается в устранении амнезирующего действия ЭШ, что характеризуется увеличением латентного времени захода в темную камеру и уменьшением времени нахождения в ней при воспроизведении рефлекса.

3.4. Амнезия, вызванная скополамином

Амнезию условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) вызывают введением скополамина (0,5–1,5 мг/кг, внутрибрюшинно) мышам или крысам за 30 мин до обучения УРПИ или непосредственно после обучения [46]. Воспроизведение УРПИ осуществляют через различные интервалы времени, наиболее часто через 24 ч. Регистрируются такие же показатели как при амнезии, вызванной ЭШ. Исследуемые вещества вводят или до обучения УРПИ и введения скополамина, или после проведения обучения, или перед воспроизведением рефлекса через 24 ч.

Ноотропный эффект во всех случаях выражается в устранении скополаминовой амнезии, что характеризуется увеличением латентного времени захода в опасный отсек камеры и уменьшением времени пребывания в нем при воспроизведении УРПИ.

Кроме максимального электрошока и скополамина в качестве амнезирующих агентов используют Н-холиноблокатор мекамиламин, ГАМК-позитивные вещества бензодиазепины, вещества, влияющие на хлорный канал барбитураты, неконкурентные блокаторы NMDA рецепторов: кетамин, дизоцилпин (МК-801), фенциклидин, конкурентный блокатор NMDA рецепторов СРР, адреноблокатор клофелин, ингибиторы белкового синтеза (циклогексемид, анизомицин), цетиловый эфир пролина, этанол.

3.5.Влияние на обучаемость

вметодике условного рефлекса активного избегания

Изучение влияния веществ на процесс обучения предпочтительно проводить, используя методику двустороннего избегания болевого раздражения через электродный пол в челночной камере типа Shuttle-box у мышей и крыс [45]. Использование модели активного избегания позволяет проводить обучение при многократных повторениях и оценить динамику выработки условного рефлекса. Установка состоит из двух отделений, разделенных перегородкой, в которой имеется дверца. Оба отделения имеют отдельно электрифицированный пол. Условным раздражителем является свет или звук, которые предъявляются за 6–10 с до безусловного раздражителя, которым является электроболевое раздражение (50–100 Гц, 20–30 В, 10 мсек), подаваемое через электродный пол поочередно то в одном, то в другом отделении. Чтобы не получить болевого раздражения, животное должно обучиться перебегать в другой отсек камеры во время действия условного сигнала (условный рефлекс). Избегание в другой отсек в ответ на действие болевого

280