3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

+1 и показывает долю активации положительной и отрицательной подкрепляющей фазы самостимуляции. Уменьшение коэффициента «рассогласования» указывает на подкрепляющих свойств самостимуляции, вследствие чего коэффициент «рассогласования» является удобным дополнительным показателем для оценки действия фармакологических препаратов. Последние вводили на 3-й день эксперимента после стабилизации реакции при использовании фиксированного значения силы тока. Регистрировали число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования» в течение 10 мин эксперимента, затем производили внутриструктурную микроинъекцию препарата и через 15–20 мин регистрировали те же показатели (число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования») за 10-минутный интервал времени.

Поскольку электрическая самостимуляция мозга является инструментальной реакцией, ложноположительные и ложноотрицательные результаты могут быть получены, если исследуемые вещества обладают способностью, соответственно, улучшать или ухудшать моторное исполнение. Для исключения влияния этого фактора применяют автотитрование, когда животное само определяет интенсивность стимуляции, которая подкрепляет оперантную реакцию. Эксперименты проводят в стандартной камере Скиннера, оборудованной двумя педалями. Каждое нажатие на одну из педалей («награждающая» педаль) запускает электрическую стимуляцию, интенсивность которой постепенно снижается. Для того, чтобы вернуть интенсивность стимуляции к исходному уровню, животное должно нажать на другую педаль (педаль «перезапуска»). Интенсивность стимуляции, при которой происходит «перезапуск», считается субъективно пороговой для данного животного.

Ежедневно проводят два сеанса самостимуляции с интервалом в 1 ч. В дни тестов поведение животного во время первого сеанса служило контролем, на основании которого рассчитывают изменение параметров самостимуляции во время второго сеанса. В дни тренировок, а также при тестировании эффектов растворителя пороговая интенсивность самостимуляции во время второго сеанса составляет 90% от исходного уровня (феномен «разогрева») [11].

3.6.4. Условнорефлекторная реакция предпочтения места

При выработке условнорефлекторной реакции предпочтения места после инъекции изучаемого вещества животных помещают в определенную обстановку. Если изучаемое вещество обладает наркогенным потенциалом, то после нескольких сеансов животные больше времени стараются проводить в месте, ассоциированном с приемом вещества.

Для обучения используют 3-х секционную камеру (например, MED Associates, St. Albans, VT). Две одинаковых по размеру камеры предпочтения с разным цветом пола (белый и черный) соединены с центральной (пол серого цвета). Камеры отделены друг от друга раздвижными дверцами с фотоэлементами, которые выводят данные на компьютер.

1 день эксперимента: мыши помещены в центральную камеру на 1 мин (период привыкания — двери закрыты) и на 20 мин (период свободного исследования двери открыты). Определяют предпочтение мышей белой или черной камеры. Мышей, которые предпочитают центральную (серую) камеру, исключают из эксперимента.

2–9 день эксперимента. Мышам вводят вещество или растворитель (в равновероятностной последовательности 1 раз в день) и помещают в соответствующую камеру. Т.е. одну мышь после введения вещества помещают в отсек с черным полом, а после введения растворителя — в отсек с белым полом; другую мышь — наоборот.

10 день тестирование. После введения вещества мышей помещают в центральную камеру и после 1 мин привыкания открывают двери. Регистрируют время проведения в каждой камере. Критерием наличия у вещества подкрепляющих свойств считают достоверно большее проведение времени в камере, ассоцицрованной с введением вещества [43].

Эксперименты можно проводить с использованием челночной камеры. Во время обучения животных после инъекции вещества помещают в один отсек челночной камеры, а после введения растворителя — в другой [11].

211

3.7. Метод оценки ульцерогенного действия веществ

Для нестероидных противовоспалительных препаратов характерно повреждающее воздействие на оболочку ЖКТ (ульцерогенное действие).

Исследуемые вещества вводят однократно внутрижелудочно крысам, предварительно за 16 ч лишенным пищи. Через 3 ч животных подвергают эвтаназии, извлекают желудки и рассекают по малой кривизне и промывают физиологическим раствором для удаления содержимого. Оценку ульцерогенного действия проводят по 4-х бальной шкале: 0 — отсутствие повреждения, 0.5 — гиперемия, 1 — единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных кровоизлияния); 2 — множественные кровоизлияния (эрозии, точечные кровоизлияния); 3 — значительные и множественные повреждения (эрозии, кровоизлияния); 4 — грубые повреждения, охватывающие всю поверхность слизистой (массивные кровоизлияния, эрозии, перфорации). Критерием ульцерогенности считают наличие проявлений, соответствующих 2 баллам и выше.

4. Изучение дополнительных нейропсихотропных свойств препаратов

4.1. Оценка двигательной активности

Самцов беспородных крыс или мышей помещают в центр установки открытого поля, освещаемой рассеянным комнатным светом. Установка для крыс представляет собой квадратную площадку размером 60×60×60 см, в которой пол был разделен на 9 квадратов (20×20 см) и имеет 16 отверстий диаметром 4 см. Установка для мышей имеет размер 40×40×40 см; пол разделен на 16 квадратов (10×10 см) и имеет 16 отверстий диаметром 3 см. В течение 2 мин регистрируют число пересеченных квадратов (горизонтальная активность), число вертикальных стоек (вертикальная активность) и число заглядываний в отверстия (норковый рефлекс) [27]. Критерием седативного или стимулирующего действия считают достоверное изменение показателей горизонтальной и вертикальной двигательной активности.

4.2. Оценка влияния на координацию движения и мышечный тонус

Для регистрации мышечного тонуса используют тест подтягивания на горизонтальной перекладине. Крыс или мышей подвешивают передними лапами на проволоку, натянутую на высоте 20–30 см от поверхности стола. Животные с ненарушенным мышечным тонусом быстро подтягиваются и удерживаются на перекладине четырьмя лапами. Невыполнение этого рефлекса животными получавшей ЛС группы свидетельствует о нарушении мышечного тонуса и неврологическом дефиците.

Установка вращающего стержня для крыс (Rota-Rod, Ugo Basile) представляет собой горизонтальный стержень Æ 7 см, разделенный пластинами Æ 25 см на 4 отсека. Установка вращающего стержня для мышей (Rota-Rod, Ugo Basile) имеет горизонтальный стержень Æ 3 см, разделенный пластинами Æ 15 см на 5 отсеков. Стержень вращают со скоростью 5 об/мин. Неспособность животных удерживать равновесие в течение 2 мин рассматривают как проявление нарушения координации движения.

4.3. Метод оценки потенцирования сна, вызванного барбитуратами

Изучаемое соединение или растворитель вводят мышам за 20 мин до гексенала, вводимого в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно. Определяют процент уснувших мышей и длительность сохранения бокового положения (в мин.) [45]. Критерием потенцирования считают увеличение продолжительности сна.

4.4. Оценка общего состояния

После введения изучаемого вещества в широком диапазоне доз (от не оказывающих заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель) регистрируют двигательную активность, нарушения ушного и корнеального рефлексов, наличие судорог,

212

тремора, птоза, прыжков, встряхиваний, стука зубами, синдрома Штрауба, чесания, чихания, бокового положения.

4.5. Оценка анксиолитического действия

Самцов беспородных крыс помещают в центр лабиринта экспериментальной камеры, которая представляет собой крестообразный лабиринт [35]. Установка приподнятого крестообразного лабиринта имеет 4 рукава длиной 30 см и шириной 6 см, скрепленных друг с другом под прямым углом. Два противоположных рукава имеют с двух сторон стенки высотой 30 см на всю их длину, а два других открыты и освещены. Лабиринт поднят над уровнем пола на высоту 40 см. Два противоположных рукава затемнены; два других — освещены рассеянным комнатным светом и открыты с торцов. Визуально регистрируют (поминутно) в течение 5 мин следующие показатели: время нахождения в светлом отсеке и число выходов в светлый отсек, время нахождения на центральной площадке, число свешиваний с открытых рукавов. Критерием анксиолитического эффекта считают увеличение времени пребывания в открытых рукавах, времени нахождения на центральной площадке, числа свешиваний с открытых рукавов.

4.6. Оценка антидепрессивного действия

Стрессовое состояние вызывают у мышей форсированным плаванием [36]. Сосуд в форме цилиндра (диаметр 10 см, высота 25 см) заполняют на треть водой (27°С) так, чтобы животное не касалось дна хвостом и не имело возможности выпрыгнуть. Самцов беспородных белых мышей помещают в этот сосуд и регистрируют визуально все активные попытки животных выбраться из воды в течение 5 мин после погружения в воду. После неудачных попыток выбраться из воды животные принимают характерную неподвижную позу, которую расценивали как проявление подавленности, «отчаяния». Критерием наличия антидепрессантного эффекта считают снижение длительности иммобилизации.

4.7. Оценка влияния на сердечную деятельность

Исследования проводят на наркотизированных крысах. Животных фиксируют на столике и с помощью электрокардиографа, например «ЭК4Т-02», регистрируют электрокардиограмму во II стандартном отведении. Графическую регистрацию проводят со скоростью 100 мм/сек. Измеряют интервалы RR, PQ, QT, комплекс QRS, рассчитывают частоту сердечных сокращений (ЧСС = 60/RR). Учитывают случаи нарушений ритма сокращений сердца. Регистрацию проводят до и после введения вещества.

5. Изучение механизма действия нового анальгетика

Механизм действия нового анальгетика следует изучать в зависимости от мишени, на которую новое вещество оказывает свой эффект, с оценкой его нейрохимических эффектов. Рекомендуется определить нейрорецепторный профиль изучаемого вещества, в том числе используя методы радиолигандного связывания, а также другие биохимические методы, в том числе изучение сдвигов нейромедиаторного баланса, вторичных мессенджеров и т.д. В частности, можно применить следующие методы оценки.

5.1. Оценка способности антагонистов опиоидных рецепторов блокировать анальгетическое действие веществ

Оценку опиоидного компонента механизма обезболивающего действия изучаемых веществ проводят с помощью анализаторов опиоидергической и каннабиноидергической систем. Тестирование болевой чувствительности по одному или двум методам оценки анальгетической активности проводят на фоне совместного введения испытуемого вещества и блокаторов разных подтипов рецепторов. Для этой цели можно использовать:

налоксон (1 мг/кг, подкожно) — неселективный антагонист опиоидных рецепторов;

213

налоксон метиодид (1 мг/кг, подкожно) — неселективный антагонист периферических опиоидных рецепторов (не проникает через ГЭБ);

налоксон бензоилгидразон (10 мг/кг, подкожно) — агонист κ3 и антагонист ORL1 орфановых и μ-опиоидных рецепторов;

налтрексон (1 мг/кг, подкожно) — неселективный антагонист опиоидных рецепторов; 3-метокcиналтрексон (5 мг/кг, подкожно) – связывается с рецепторами морфин-6-b-

глукуронида и блокирует анальгезию, вызванную эндоморфином-2; АМ-251 (5 мг/кг, подкожно) — антагонист СВ1 каннабиноидных рецепторов;

налоксоназин (10 мг/кг, подкожно) — антагонист μ1-опиоидных рецепторов; налтриндол (5 мг/кг, подкожно) — антагонист δ-опиоидных рецепторов; нор-биналторфимин (nor-BNI) (5 мг/кг, подкожно) — антагонист κ-опиоидных ре-

цепторов.

5.2. Метод оценки взаимодействия опиоидных анальгетиков на препаратах изолированных органов

Для оценки опиоидного рецепторного механизма действия исследуемых веществ оценивают их влияние на вызванные стандартной электрической стимуляцией сокращений изолированного сегмента подвздошной кишки морской свинки (богатой μ-опиоидными рецепторами), семявыносящего протока мыши (богатого δ-опиоидными рецепторами) и семявыносящего протока кролика (богатого κ-опиоидными рецепторами), а также способности налоксона устранять или ослаблять угнетающее действие изучаемого вещества.

Для выделения препаратов семявыносящего протока мыши и подвздошной кишки морской свинки животных подвергают эвтаназии цервикальной дислокацией, вскрывают брюшную полость, выделяют соответствующий орган и помещают его в чашку Петри, наполненную буфером Кребса (118 мМ NaCl; 2,54 мМ CaCl2; 4,75 мМ KCl; 1,19 мМ KH2PO4; 25 мМ NaHCO3; 11 мМ глюкоза) [23].

Для приготовления препарата подвздошной кишки морской свинки отсекают 10 см концевого отдела подвздошной кишки, затем аккуратно удаляют слой слизистой оболочки вместе с брыжейкой, кишку с внутренней полости натягивают на стеклянную палочку и с помощью ватного тампона поступательными движениями снимают наружный слой гладкой мышечной мускулатуры. Для приготовления препарата семявыносящего протока мыши вскрывают брюшную полость мыши, выделяют семявыносящие протоки, удаляют слой слизистой оболочки.

Конечный препарат длиной 10–15 мм фиксируют одним концом на держателе с платиновыми электродами, переносят в рабочую камеру, наполненную буфером Кребса, и закрепляют второй конец на чувствительном элементе механотрона. Буфер насыщают карбогеном (95% O2, 5% CO2).

На электроды подают электрические импульсы прямоугольной формы. Сокращение препарата регистрируют с помощью механотрона и преобразованные электрические сигналы фиксируют самописцем. Раствор исследуемого вещества добавляют в камеру с помощью микропипетки. Наличие агонистической/антагонистической активности исследуемого вещества проверяют добавлением в камеру эквивалентной концентрации раствора налоксона. По окончании регистрации систему промывают буфером.

5.3. Методика радиолигандного связывания

Желательно провести лиганд-рецепторный анализ для получения представлений о механизме действия изучаемого вещества. Этот метод позволяет непосредственно качественно и количественно оценить взаимодействие вещества с рецептором, изучить связь между структурой и действием, провести сравнительную оценку соединений по силе взаимодействия с рецептором. Соединения, обладающие анальгетическим действием, могут принадлежать разным фармакологическим классам, и выбор радиолиганда основывается на результатах исследований с анализаторами нейромедиаторных систем.

214

5.4.Метод регистрации биоэлектрической активности головного мозга на фоне исследуемого вещества

Желательно провести исследования регистрации биоэлектрической активности головного мозга на фоне исследуемого вещества. Исследования проводят в первую половину дня на самцах беспородных белых крыс. В мозг крысы вживляют долгосрочные электроды для регистрации биоэлектрической активности. Электроды вживляют в сенсомоторную область коры (+2, +2, +1–1,5), дорзальный гиппокамп (+2, +0,8–1, +3,5), латеральный гипоталамус (0, +0.2–0.5, +6.5), амигдалу (+1, +3, +7,5), ретикулярную формацию ствола мозга (+6,5, +1,5, +6,8–9,2) — структуры, принимающие участие в проведении ноцицептивных сигналов и формировании ответных реакций. Индифферентный электрод вживляют в носовую кость черепа. Координаты подкорковых структур (от Брегмы, сагитально, глубина) рассчитывают по атласу мозга крыс, приведенному Буреш и соавторами (1962). Операции проводят под хлоратгидратным наркозом (3%, 300 мг/кг, в/м).

Электроды изготавливают из нихромовой проволоки диаметром 120 микрон, в лаковой изоляции. Кончик электрода зачищают. Концы электродов припаивают к серебряным штырькам, которые крепятся на поверхности черепа зубным висфат-цементом. Регистрацию ЭЭГ проводят в экранированной камере в условиях свободного поведения животных. Для того, что бы избежать артефактов от движения штырьков, используют специальные пружинные контакты. Отводящие провода помещают в общий «экран», который заземляют. При обработке сигналов используют фильтр на 32 Гц и с постоянной времени 0,03. Компьютерный анализ ЭЭГ осуществляют с помощью специальзированных программ (например, «Brainsys»). Программный комплекс выполняет следующие функции: ввод в компьютер многоканальной ЭЭГ и ее визуальное редактирование; фильтрацию, выделение артефактов и их устранение из анализируемого отрезка ЭЭГ; спектральный и когерентный анализ ЭЭГ и статистическую обработку полученных результатов.

При изучении влияния веществ на биоэлектрическую активность мозга крыс регистрация ЭЭГ производят до и после инъекции препаратов. Вычисляют изменения спектра мощности биоэлектрической активности мозга крыс на фоне действия препаратов с последующей статистической обработкой данных по методу Стьюдента.

5.6.Методы оценки взаимодействия вещества

санализаторами различных нейромедиаторных систем

Желательно получить представление о влиянии изучаемого вещества на эффекты

анализаторов нейромедиаторных систем, в частности 5-окситриптофана, ареколина, апоморфина и др.

5.6.1. Тест встряхивания головой, вызванного 5-окситриптофаном

5-окситриптофан вызывает у мышей характерный кинез в виде резких встряхиваний головой, что объясняется активацией серотонинергической системы. Изучаемое соединение вводят самцам беспородных мышей до внутрибрюшинной инъекции 5-окси- триптофана в дозе 200 мг/кг (доза, вызывающая гиперкинез может колебаться от 100 до 400 мг/кг). Количество специфических встряхиваний головы подсчитывают за период с 3 по 12 минуту после введения 5-окситриптофана (период регистрации подбирается в зависимости от активности в контрольной группе) [17]. Критерием антисеротонинового действия считают уменьшение числа встряхиваний головой.

5.6.2. Тест тремора, вызванного ареколином или оксотреморином

Ареколин или оксотреморин вызывают тремор у самцов беспородных мышей, связанный с активацией М-холинорецепторов. Изучаемое соединение вводят до подкожного введения ареколина в дозе 25 мг/кг или оксотреморина в дозе 0.5 мг/кг. Регистрируют продолжительность тремора [38]. Критерием холиноблокирующего действия считают уменьшение длительности тремора.

215

5.6.3. Тест вертикализации, вызванной апоморфином

Апоморфин гидрохлорид в дозе 5 мг/кг вызывает стереотипию у самцов беспородных мышей, проявляющуюся в вертикализации (доза, вызывающая вертикализацию, может колебаться от 2 до 7.5 мг/кг). Мышей помещают в цилиндрическую проволочную клетку диаметром 13 см и высотой 16 см. Изучаемое соединение вводят до подкожного введения апоморфина. Через 10 мин после введения апоморфина оценивают интенсивность вертикализации по четырехбальной системе (по числу лапок, которыми животное держалось за вертикальную стенку) [44]. Регистрацию проводят каждые 2 мин на протяжении часа. Таким образом, максимальное число баллов составляет 120. Критерием дофаминоблокирующего действия считают уменьшение интенсивности вертикализации, оцененной в баллах.

5.6.4. Тест стереотипии, вызванной апоморфином

Апоморфин гидрохлорид в дозе 0.75 мг/кг вызывает стереотипию у самцов беспородных крыс. Изучаемое соединение вводят до подкожного введения апоморфина. Интенсивность стереотипии определяют через 20 мин после инъекции апоморфина и оценивают в баллах (максимальное число баллов равно 4): 1 — единичные стереотипные движения; 2 — нестойкая стереотипия; 3 — стойкая отвлекаемая стереотипия; 4 — стойкая неотвлекаемая стереотипия. Отвлекаемость определяют по хлопку в ладоши рядом с животным. Учитывают такие формы стереотипного поведения крыс, как принюхивание, укусы, зевания, лизания, горизонтальные покачивания головы, стойки, прыжки. Критерием дофаминоблокирующего действия считают уменьшение интенсивности стереотипии, оцененной в баллах.

Заключение

Результаты экспериментального изучения нового препарата с анальгетическим действием должны содержать материалы, доказывающие наличие у него специфической анальгетической активности, а также отличия и преимущества нового препарата перед уже известными анальгетиками. В исследовании должны быть обязательно представлены результаты сравнительного изучения нового анальгетика с референтыми препаратами сравнения. Обязательными тестами в исследовании являются следующие: тест отдергивания хвоста от теплового излучения (tail-flick) или тест тепловой иммерсии хвоста при погружении в горячую воду, тест горячей пластины (hot plate), тест механического раздражения основания хвоста по Гаффнеру или тест механического раздражения лапы или хвоста по Randall и Selitto, метод оценки соматической боли, вызванной формалином, тест механического раздражения воспаленной лапы (каррагениновый тест), метод оценки висцеральной боли, вызванной уксусной кислотой (тест уксусных корчей). При необходимости оценки влияния препарата на нейрогенную боль следует также использовать соответствующие методы, представленные в данных рекомендациях.

Необходимо обязательно провести оценку сопутствующих и возможных нежелательных эффектов, используя один из методов оценки влияния веществ на частоту дыхания, методы оценки влияния вещества на моторику ЖКТ и на температуру тела. Необходимо при длительном введении препарата исследовать развитие толерантности к нему и синдрома отмены при прекращении введения препарата без провокации налоксоном и при провокации налоксоном. Необходимо провести исследования по изучению подкрепляющих и стимульных свойств, хотя бы по одному из изложенных выше методов. Необходимо представить данные по механизму действия исследуемого препарата.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

216

Литература

1.Колотилова А.Б., Гузеватых Л.С., Валуйских Д.В., Емельянова Т.Е. Роль опиоидной системы в изменении болевой чувствительности, вызванном холодной и жаркой температурой окружающей среды // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008. — Т.145, № 6. — С. 652–655.

2.Крыжановский Г.Н. Центральные механизмы патологической боли // Журнал неврологии и психиатрии. — 1999. — Т. 99, № 12. — С.4–7.

3.Крыжановский Г.Н., Решетняк В.К., Кукушкин М.Л., Горизонтова М.П., Смирнова В.С. Болевой синдром у крыс после повреждения седалищного нерва // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 1991. — Т.6. — С. 8–9.

4.Кукушкин М.Л., Игонькина С.И. Роль 5-HT3 рецепторов в механизмах развития центрального болевого синдрома // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2003. — 135(6). — 647–652.

5.Кукушкин М.Л., Игонькина С.И., М.В. Чурюканов, В.В. Чурюканов, Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Грецкая Н.В. Роль агонистов каннабиноидных рецепторов в механизмах подавления центрального болевого синдрома // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2006. — Т. 142, № 7. — С. 47–51.

6.Кукушкин М.Л., Хитров Н.К. Общая патология боли // М.: Медицина. — 2004. — 144 с.

7.Лебедев А.А., Шабанов П.Д. Сопоставление реакции самостимуляции и условного предпочтения места при введении фенамина у крыс // Журнал высшей нервной деятельности. — 1992. — Т. 42, Вып. 4. — С. 692–698.

8.Чурюканов В., Чурюканов М. Фармакология болеутоляющих средств // Врач. — №4. — 2002. — С. 29–33.

9.Abbott F.V., Franklin K.B.J. Noncompetitive antagonism of morphine analgesia by diazepam in the formalin test // Pharmacol. Biochem. Behav. — 1986. — V. 24. — P. 319–321.

10.Ben-Bassat J., Peretz E., Sulman F.G. Analgesimetry and ranking of analgesic drugs by the receptacle method // Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. — 1959. — V. 122. — P. 434–447.

11.Bespalov A., Dumpis M., Piotrovsky L., Zvartau E. Excitatory amino acid receptor antagonist kynurenic acid attenuates rewarding potential of morphine // Eur. J. Pharmacol. — 1994. — V. 264(3). — P. 233–239.

12.Bespalov A., Lebedev A., Panchenko G., Zvartau E. E ects of abused drugs on thresholds and breaking points of intracranial self-stimulation in rats // Eur. Neuropsychopharmacol. — 1999. — V. 9(5). — P.377–383.

13.Bianchi C., Francheschini J. Experimental observations on Ha ner's method for testing analgesic drugs // Br. J. Pharmacol. — 1954. — V. 9. — P. 280–284.

14.Chaplan S.R., Bach F.W., Pogrel J.W., Chung J.M., Yaksh T.L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw // J. Neurosci. Methods. — 1994. — V. 53(1). — P. 55–63.

15.Chernov H.I., Wilson D.E., Fowler W.F., Plummer A.J. Non-specificity of the mouse writhing test // Arch Int Pharmacodyn Ther. — 1967. — V. 167(1). — P. 171–178.

16.Clavelou P., Dallel R., Orliaguet T., Woda A., Raboisson P. The orofacial formalin test in rats: e ects of di erent formalin concentrations // Pain. — 1995. — V. 62(3). — P. 295–301.

17.Corne S.J., Pickering R.W., Warner B.T. A method for assessing the e ects of drugs on the central actions of 5-hydroxythyphamine // Br. J. Pharmacol. — 1963. — V. 20. — P. 106–120.

18.Courteix C., Eschalier A., Lavarenne J. Streptozotocin-induced diabetic rats: behavioral evidence for a model of chronic pain // Pain. — 1993. — V. 53. — P. 81–88.

19.D’Amour F.E., Smith D.L. A method for determining loss of pain sensation // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1941. — V. 72. — P. 74–79.

20.Fernandes M., Kluwe S., Coper H. Quantitative assessment of tolerance to and dependence on morphine in mice // Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. — 1977. — V. 297. — P.53–60.

21.Gordon C.J. Thermal biology of the laboratory rat // Physiol. Behav. — 1990. — V.47. — V 5. — P. 963–991.

22.Hargreaves K., Dubner R., Brown F., Flores C., Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia // Pain — 1988. — V. 32. — P.77–88.

23.Hughes J., Smyth T. W., Kosterlitz H. W., Fothergill L. A., Morgan B. A., Morris H. R. Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity // Nature. — 1975. — V. 258. — V. 5536. — P. 577–579.

24.Hunskaar S., Hole K. The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and noninflammatory pain // Pain. — 1987. — V. 30(1). — P. 103–114.

217

ГЛАВА 13

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

С ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Составители: д. м. н., проф. Т.А. Воронина; д. м. н., проф. Е.А. Вальдман; к. б. н. Л.Н. Неробкова; к. б. н. И.Г. Капица

Введение

Паркинсонический синдром (ПС) является проявлением ряда заболеваний различной этиологии — первичного паркинсонизма, включающего собственно болезнь Паркинсона; вторичного (сосудистого, травматического, токсического, вызываемого рядом ЛП), а также различных форм мультисистемной дегенерации. При ПС проявляется классическая триада симптомов — тремор, ригидность и олигокинезия. Несмотря на различия в этиологии, патогенетическая основа всех форм ПС одинакова. Основные нарушения при ПС связаны с нейродегенеративными процессами в базальных ядрах головного мозга. Дегенерация дофаминовых (ДА) нейронов в нигростриатуме, преимущественно в компактной части черной субстанции, является патохимическим коррелятом основных симптомов ПС — акинезии и ригидности. Недостаточность тормозного действия ДА нигростриатума приводит к гиперактивации холинергических (ХЭ) нейронов, с которой связывают проявления основных двигательных расстройств при ПС, особенно тремора. Кроме черной субстанции, патологические процессы при ПС развиваются в стриатуме, бледном шаре, вентролатеральном ядре таламуса и субталамических ядрах. Таким образом, дефицит ДА и гиперактивация ХЭ нейронов считается основным патогенетическим звеном паркинсонического синдрома. В зависимости от преобладания той или иной основной симптоматики в клинике выделяют акинетическую, акинетико-ригидную, ригидно-дрожательную и дрожательную формы ПС. Возникновение определенной формы ПС зависит прежде всего от того, нарушение какой медиаторной системы является инициальным звеном патологического процесса.

Группа противопаркинсонических средств включает в себя препараты различного механизма действия, направленного на основные звенья патогенеза ПС. Наибольшее значение имеют средства, повышающие дофаминергическую передачу. В качестве средства заместительной терапии широко используется метаболический предшественник ДА — L-дофа (диоксифенилаланин) (леводопа), который в отличие от ДА проходит через гематоэнцефалический барьер и при участии дофадекарбоксилазы превращается в ДА. С целью уменьшения периферических побочных эффектов применяют комбинированные средства — L-дофа с ингибиторами периферического декарбоксилирования (ДДК) — синемет, наком — или бенсеразидом (мадопар). В 2003 г. впервые был разработан новый комбинированный препарат, включающий 3 компонента: леводопу, ингибитор ДДК и энтакапон: ингибитор фермента катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) — «СТАЛЕВО» (24 левин). Широко используются агонисты ДА рецепторов — парлодел (бромкриптин), лизурид, перголид, и ингибиторы МАО-В — селегелин, юмекс, депренил. В качестве монотерапии на ранних стадиях и в комплексной терапии применяются также холинолитические препараты — циклодол, паркопан, биперидин, акинетон и др. Отдельное место занимает амантадин (мидантан), механизм действия которого связывают с непрямым до-

219

фаминергическим и холинолитическим эффектами за счет блокады NMDA-рецепторов. Однако большинство противопаркинсонических препаратов имеют много побочных эффектов и обладают ограниченной эффективностью, поэтому поиск новых средств лечения ПС остается актуальным.

Изучение активности потенциальных противопаркинсонических препаратов проводят на моделях ПС. Обычно прибегают к различным способам угнетения ДА передачи, прежде всего в нигростриатуме или активации ХЭ нейронов. Два типа этих моделей различаются по динамике развития процесса и его проявлениям и рассматриваются как воспроизводящие, соответственно, акинетико-ригидную иди дрожательную формы ПС. При угнетении ДА передачи ПС возникает медленно, продолжается несколько суток, начинается с олигокинезии; преобладает акинетико-ригидная форма. Редукция симптомов начинается с ригидности, и их выраженность зависит от возраста животных. ПС при активации ХЭ системы развивается быстро, продолжается несколько часов, начинается с тремора, преобладает ригидно-дрожательная форма, редукция симптомов начинается с тремора, возраст экспериментальных животных существенного значения не имеет.

Результаты экспериментального изучения нового препарата должны содержать материалы, доказывающие наличие у него выраженной противопаркинсонической активности и преимуществ перед уже известными средствами.

Исследования следует проводить на различных видах лабораторных животных, например, мышах и крысах, а при необходимости можно использовать и более крупных животных (обезьян). По каждому тесту вещество изучают не менее чем в трех дозах. Должны быть использованы по меньшей мере два способа введения, один из которых соответствует предполагаемому клиническому способу применения препарата. Не менее чем по одному из основных тестов необходимо изучить кривую зависимости доза– эффект и определить продолжительность эффекта при использовании пути введения, соответствующего предлагаемому в клинике. Исследование противопаркинсонической активности вещества проводится обязательно в сравнении с наиболее известными эталонными препаратами этого же типа действия.

Полученные данные обрабатываются с помощью современных методов статистики и представляются в виде таблиц, а при необходимости — рисунков.

Основные методы оценки противопаркинсонической активности фармакологических средств

1. Методы оценки противопаркинсонической активности, основанные на угнетении дофаминергической передачи

Методы, основанные на угнетении ДА передачи, включают тесты, моделирующие развитие каталепсии и других экстрапирамидных нарушений введением дофаминергических веществ, а также модель ПС, индуцированного нейротоксином 1-метил-4-фенил-1, 2, 3, 6-тетрагидропиридином (МФТП), вызывающим избирательное повреждение ДА нейронов.

Каталепсию вызывают, как правило, введением различных нейролептиков, из которых чаще всего используют галоперидол и трифтазин. Типичные нейролептики вызывают блокаду ДА рецепторов, и при их назначении в больших дозах даже при однократном применении наблюдается развитие экстрапирамидных нарушений. Следует отметить, что данная модель имеет ряд недостатков. Под действием нейролептиков дегенеративные изменения в ДА нейронах и их терминалях не развиваются, в то время как при ПС отмечается гибель не менее 70–80% ДА нейронов компактной части черной субстанции. Однако данные методики моделируют выраженную каталепсию и позволяют установить наличие ДА звена в механизме действия исследуемого соединения и поэтому широко используются для оценки противопаркинсонических средств. Кроме того, для создания экстрапирамидных нарушений используется резерпин, вызывающий ДА-дефицитное состояние путем истощения запасов катехоламинов в ЦНС. Наиболее адекватной моделью ПС в настоящее время при-

220